新闻中心
News Center
项目文章 │ MeRIP-qPCR产品线登陆1区Top期刊Advanced Science
发布时间:2023-12-08

细胞通过整合素偶联的黏着斑(FAs)感知细胞外基质(ECM)的物理特性,影响细胞迁移、分化和存活。由于组织纤维化和ECM硬化与肿瘤预后不良相关,通过胶原蛋白消耗或赖氨酸氧化酶(LOX)抑制来改变ECM硬化,或通过药物改变细胞机械转导已成为癌症治疗的有前景的选择。然而,肿瘤细胞也表现出对失巢凋亡-ECM脱离诱导的细胞死亡的抵抗。肿瘤细胞如何在硬基底上获得生长优势,同时在失黏附时抵抗细胞死亡仍然是一个谜。

 细胞生长和增殖与细胞合成代谢密切相关。失巢凋亡抗性也与代谢适应同时发生,可被自噬所阻碍。雷帕霉素复合物1(mTORC1)的机制靶点是响应细胞内和细胞外信号的代谢调节的中心支柱,其激活与增强蛋白翻译和减少自噬有关。mTORC1被招募到溶酶体表面以释放其抑制作用。近的研究表明,溶酶体mTORC1可以被运输到FAs周围并被激活,FAs是连接ECM与细胞内部的基于整合素的机械转导枢纽。然而,目前仍缺乏证据表明基质的物理性质是否可以通过mTORC1途径发出信号。


“昊”客户项目文章

2023年12月2日,北京大学基础医学院系统生物医学研究所吴聪颖课题组于Advanced Science杂志(IF:15.1,1区Top)在线发表文章“mTORC1 mediates biphasic mechano-response to orchestrate adhesion-dependent cell growth and anoikis resistance”,揭示了mTORC1途径在硬基底或基底脱离时的机械调节现象和潜在机制。基底硬度和细胞张力的增加通过整合素、GSK3β和涉及擦除蛋白FTO的mRNA m6A修饰增强了mTOR的活性和丰度,有利于细胞生长。同时,ECM脱离下的肿瘤细胞也使用了同样的机器,在体外、人乳腺导管原位癌和小鼠恶性腹水中观察到mTORC1活性降低及自噬增强,并伴有失巢凋亡抗性。该研究结果表明,肿瘤细胞利用细胞代谢的双相机械调节来协调细胞在硬基质上的生长及在失黏附时的抗凋亡,靶向整合素-GSK3β-FTO-mTOR信号轴可能实现癌症的双重打击策略。




天昊生物有幸参与了其中的MeRIP-qPCR实验及数据分析工作,文章的主要研究结果总结如下:


1. mTORC1激活介导硬培养条件下细胞生长增加

相对于软基质条件,硬基质显著增加了细胞生长(图1A)。为了揭示硬基质所赋予的生长优势的主要参与者,利用RNA测序分析硬基质中上调的特征基因(图1B),结果MsigDB和KEGG数据库分析均发现mTORC1信号通路显著富集(图1B)。利用雷帕霉素抑制mTORC1,细胞增殖显著被抑制(图1A)。进一步实验说明mTORC1参与基质硬度和细胞收缩下游的细胞生长调节,并证实mTORC1激活可能是对基质硬化或细胞骨架收缩的广泛反应。


图1 基质硬度激活mTORC1通路促进细胞生长


2.黏着斑通过基质硬度介导mTORC1激活

基于整合素的黏着斑(FA)感知ECM的物理特性并将机械信号传递到细胞中。通过免疫荧光染色检测到mTOR与FA标记蛋白paxillin或vinculin在硬基质而非软基质上的强共定位。类似地,硬基质特异性FA定位也发生在phos-S6中,表明mTORC1激活(图2A, B)。一系列数据表明FA在硬基质诱导的mTORC1激活中起关键作用。

图2 mTORC1在硬基质上的激活受基于整合素的FAs调控

为了进一步解析mTORC1机械激活的机制,作者将重点放在整合素上,它将ECM与细胞骨架联系起来,并在质膜上传递机械信号。利用siRNA筛选文库靶向不同的整合素,证实了整合素β1在硬度介导mTORC1激活中发挥重要作用。


3.软基质通过调节m6A RNA甲基化降低mTOR蛋白丰度

另一方面,实验证实软基质下或更低收缩力条件下mTOR水平的下降是由于抑制了蛋白质合成而不是增强了降解。而在抑制收缩条件下(布雷他汀处理)转录本水平的降低可能是mTOR mRNA稳定性下降的结果。

作为哺乳动物mRNA上丰富和普遍的修饰,腺苷N6位点的甲基化(m6A)已被证明通过影响mRNA的稳定性和翻译来调节细胞代谢和存活,特别是当甲基化发生在关键的代谢转录本上时。由于mTOR转录本包含几个长外显子(图3G),这些外显子可以被m6A修饰调控。进而探索m6A修饰是否可能介导mTOR mRNA和蛋白丰度的调控。在线软件SRAMP预测了位于mTOR mRNA 3'UTR的5个非常高置信度的修饰位点(图3H)。

图3 基质硬度介导了mTOR丰度和m6A水平

基于预测,使用基因特异性m6A RNA免疫沉淀-qPCR(MeRIP-qPCR)分析了这些潜在修饰位点上的m6A水平。值得注意的是,布雷他汀处理后,所有5个位点的m6A修饰均升高(图S3E,F)。这些数据表明,在不同的硬度或细胞收缩性条件下,硬度敏感m6A的改变可能导致mTOR蛋白丰度的改变。

图S3 mTOR的m6A水平随肌动球蛋白收缩力的降低而增加


4. GSK3β可以定位到FA区并磷酸化FTO以激活mTORC1

在寻找影响mTOR m6A修饰的关键调控酶的实验中,发现FTO的敲除消除了不同硬度条件下mTOR蛋白和phos-S6水平的差异(图4A)。mTOR mRNA和FTO之间的相互作用可能在低收缩性下被破坏,留下更多的m6A修饰完整而没有被有效擦除(图4C)。并进一步揭示FTO翻译后修饰在mTORC1通路的机械调控中的作用。总的来说,这些数据揭示了mRNA m6A甲基化可以与基质硬度协调,通过FTO磷酸化调节mTORC1途径。

图4 GSK3β通过与整合素的相互作用,在磷酸化FTO中起着至关重要的作用

进而寻找影响FTO磷酸化修饰的调控因子,免疫沉淀质谱发现GSK3β与FTO存在相互作用,在硬基质条件下抑制GSK3β能够降低FTO磷酸化。生化实验证实了GSK3β在基质硬化诱导的FTO和mTORC1激活中的潜在作用,并且潜在的机制可能涉及整合素β1。

总结如下:机械力广泛参与各种生物过程,包括细胞增殖、分化和迁移,其需要代谢重组。作为合成代谢的主要调节因子,mTORC1一直是细胞生长和肿瘤生存研究的重点,然而,其与机械微环境的关联在很大程度上缺失。本研究证实了整合素-GSK3β-FTO-mTOR轴在软基质条件下下调并影响细胞自噬(图5)。

640.png

图5 整合素-GSK3β-FTO-mTOR轴介导mTORC1调控响应不同基质硬度






copyright © 2008-2023 天昊生物 reserved. ICP备案序号:沪ICP备18028200号-1沪公网安备 31011502016782号