天昊生物多年专注于深耕遗传学和基因组学等领域科研特色技术的开发,不断跟进国际先进的科研成果及技术发展,创新研发了许多特色专利技术和领域内前沿的检测服务项目,受到广大专业科研用户的认可和好评。
天昊生物肿瘤内生菌绝对拷贝数检测,采用“16S qPCR绝对定量 + 16S rDNA扩增子测序”策略,可以根据qPCR绝对定量和16S rDNA扩增子相对定量测序结果,计算样品中微生物的绝对丰度。该技术将为肿瘤内生菌对肿瘤的发生发展及治疗预后效果等研究,提供了新的分析方法。
技术路线:
16S qPCR实验技术路线
技术优势:
1、qPCR绝对定量检测采用的是TaqMan探针法而不是常见的SYBR green方法,可以获得更高特异性结果。
2、qPCR绝对定量检测,采用细菌16S rDNA佳的通用引物。
3、本实验16S rDNA扩增子测序采用的是高特异性、高灵敏度的扩增体系,极大程度上降低了宿主的非特异性扩增。
4、目前我们的“天昊云”在线分析平台,已经上线配套的分析工具,便于项目客户对获得的qPCR绝对拷贝数和扩增子测序结果进行在线分析,真正实现了生信分析的自主高效。
样品类型:主要针对肿瘤组织及DNA进行检测,可以是常规的新鲜冷冻组织样本,也可以是石蜡样本(未经染色),以及完整无污染的基因组DNA
样品需求量:DNA≥50 ul(指按照DNA抽提试剂盒说明书要求的组织重量和洗脱体积进行抽提得到的DNA原液)(满足2次qPCR+测序实验);常规的软组织样本(样本需求量>=200mg,绿豆大小),未经染色处理的石蜡保存类型的样本,送样量不低于5片(10um厚度,组织大小在1cm2)
送样方式:每个离心管用parafilm膜密封,冰袋运输
DNA提取建议:常规组织样本选择FastDNA® Spin Kit for Soil(116560200,MP)进行DNA抽提,FFPE样本选择石蜡包埋组织 DNA 快速提取试剂盒(DP330,天根)进行DNA抽提
16S rDNA扩增子测序及与qPCR绝对定量检测数据的联合分析(天昊云)
1、16S TaqMan qPCR部分:
提供qPCR原始数据,以及导出的Ct值数据,结果达到:
a. 标准曲线梯度:拟合系数:R2 ≥ 0.99;
b. 3技术重复CV% < 5%(Ct < 30)。
2、16S扩增子测序部分:
提供PE250的fastq数据,以及相对定量测序分析内容,结果达到:
a. 总数据量 ≥ 5万reads;
b. Clean data Q30 ≥ 80%。
1. Fu A, Yao B, Dong T, et al. Tumor-resident intracellular microbiota promotes metastatic colonization in breast cancer. Cell, 2022, 185(8): 1356-1372. e26.
2. Yao B, Dong T, Fu A, et al. Quantification and characterization of mouse and human tissue-resident microbiota by qPCR and 16S sequencing. STAR protocols, 2022, 3(4): 101765.
1、样本DNA浓度偏低,Qubit检测无浓度值的样本是否能进行内生菌绝对拷贝数检测?
答:样本总DNA浓度无法代表目标基因的模板量,无法根据DNA的浓度来估算16S rRNA基因的拷贝数,建议进行16S rRNA基因Taqman qPCR检测的预实验,根据预实验结果来决定样本是否继续进行正式检测。
其中针对低质量的石蜡肿瘤组织样本,由于样本本身保存方式造成的核酸降解、突变等情况,可能会造成检测结果拷贝数偏低,甚至出现假阴性结果的风险。
2、样本同时进行16S TaqMan qPCR绝对拷贝数检测和16S扩增子测序,如何进行联合分析,得到微生物在绝对拷贝数水平上的群落结构差异?
答:登录公司网站www.geneskybiotech.com,进入天昊云平台,选择“微生物qPCR绝对定量”项目,按照提示输入数据,运行程序,即可得到微生物在绝对拷贝数水平上的群落结构差异结果。详细可咨询生物信息部。
3、16SV4区域扩增子测序结果中是否有高比例的宿主序列存在?
答:实验采用的是高特异性、高灵敏度的扩增体系,极大程度上降低了宿主的非特异性扩增。目前测试项目16S的扩增子测序结果中(人,小鼠),几乎没有宿主序列的占比。
copyright © 2008-2023 天昊生物 reserved. ICP备案序号:沪ICP备18028200号-1沪公网安备 31011502016782号