Olink®基于PEA（Proximity Extension Assay，邻位延伸分析）技术，采用两个抗体识别相同的目的蛋白，通过免疫反应两个抗体上连接的寡核苷酸彼此临近，经过延伸和扩增反应，将蛋白浓度转化为寡核苷酸的定量检测结果。Olink®技术具有特异性强、灵敏度高、检测蛋白浓度范围广、通量高等优势，可以在临床研究中助力药物靶点筛选、疾病风险预测和患者分层等研究。

技术路线：

技术优势：

•高灵敏度：低检测下线可达fg/mL级别；

•高动态范围：检测范围可跨越10个数量级；

•高特异性：可识别相似度90%的同源蛋白；

•极低样本量：低只需1µL血清或血浆；

•高灵活性：可同时检测96/384/1536/3072种蛋白；

•广泛样本类型：满足血清、血浆、不同体液及组织样本需求。

血清/血浆样本：离心收集血浆/血清后，每管至多1 mL装；单次检测实验需≥50 µL，且无溶血现象，建议送样≥ 100 µL。每个离心管用parafilm膜密封，样品需-80℃保存，干冰运输，保证运输途中干冰不会完全融化。

血清采集步骤：

a) 采集：血液样本的采集按部位可分为静脉采血、动脉采血等，按采血方式又可分为普通采血法和真空采血法等。根据研究需求选择适宜的采血方式。采用洁净的非抗凝管采集新鲜全血，并标记清楚样本编号；

b) 凝血：将采集到的全血室温下放置30 min；

c) 离心：凝血结束后，将采血管置于离心机中离心，离心条件为：离心力 1500 g，时间 10 min，温度室温。如不能及时处理，将样本至于4℃冰箱2 h 内离心；

d) 分装：离心后的上清液即为血清，用移液器小心吸取并分装至洁净的冻存管中，做好标记；

e) 速冻：血清分装至冻存管后应立即竖直置于液氮中速冻，速冻时间约30 s；

f) 储存：速冻后转运储存于液氮或-80℃冰箱中。

血清采集注意事项：

a) 材料准备 冻存管、离心管、枪头等材料必须保持洁净，避免污染。

b) 采血过程需等消毒剂（乙醇、异丙醇等）完全挥发后采样。

c) 采血过程中一定要避免溶血发生，血液掺杂异物、剧烈震荡、离心转速过快等均可能导致溶血。

d) 避免反复冻融。

e) 采集过程中，样品放置时间，离心时间等保持一致。

f) 血清得率约 30-50%，1 mL 外周血可得约 0.3-0.5 mL 血清。

g) 血液样品优先选用血清，其次才是血浆。

血浆采集步骤：

a) 采集：根据研究需求选择适宜的采血方式。 采用洁净的加有抗凝剂的采血管采集新鲜全血，轻柔颠倒混匀并标记清楚样本编号；

b) 离心：全血采集至抗凝采血管后需尽快离心，如不能立即离心，应立即保存于4℃冰箱，2 h内离心分离。离心条件为：离心力1600 g，时间15 min，温度4℃；

c) 提取：离心后的上清液即为血浆，用移液器小心吸取上部清液至洁净的离心管中；

d) 分装：用移液器小心吸取上清液并分装至冻存管中，做好标记；

e) 速冻：血浆分装至冻存管后应立即竖直置于液氮中速冻，速冻时间约30 s；

f) 储存；速冻后转运储存于液氮或-80℃冰箱中。

血浆采集注意事项：

a) 推荐使用EDTA 抗凝；血浆样品不推荐使用柠檬酸做抗凝剂。

b) 采血过程需等消毒剂（乙醇、异丙醇等）完全挥发后采样。

c) 采血过程中一定要避免溶血发生，血液掺杂异物、剧烈震荡、离心转速过快等均可能导致溶血。

d) 避免反复冻融。

e) 采集过程中，样品放置时间，离心时间等保持一致。

f) 分装使用的离心管尽可能使用低吸附离心管。

g) 血浆得率约50%，1 mL外周血可得约 0.5 mL血浆。

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1.Olink蛋白质组学检测平台可以提供哪些蛋白检测？

答：目前可以提供Target 48和Target 96的检测，其中Target 48包含45/43个细胞因子相关蛋白生物标志物的检测，Target 96包括92个蛋白生物标志物的检测，不同的检测panel针对特定的疾病或生物通路，可根据研究目的灵活选择。

2.Olink平台有哪些质量控制体系？

答：Olink设置了严格的内部和外部对照，以便监测体系的稳定性和实现数据的标准化。内部对照为加入到样本中的参照，根据监测步骤的不同，分为免疫反应对照（两个非人源/鼠源的蛋白）、延伸对照（两条探针同时偶联在一个抗体上的复合物）和检测对照（双链DNA）。外部对照包括3个板间对照（对应检测panel的92个寡核苷酸标记抗体的混合物，或对应检测panel的外源重组靶蛋白混合物）、3个阴性对照和2个样本对照（Olink提供的血浆样本）。其中板间对照检测结果的中位数可以用于同一板检测数据的归一化计算；阴性对照可以反映每个蛋白检测反应的背景并计算检测限；样本对照可以用于计算板内和板间的%CV。

3.Olink平台如何对数据进行校正？

答：Olink使用NPX参数表示归一化校正后的蛋白相对表达量，其计算公式为：

其中校正系数是一个预定值，在Olink官方进行panel验证过程中计算得到，与阴性对照相关，可将终的检测数值转化为与蛋白浓度正相关的形式展示。

4.溶血对检测的影响？

答：溶血通常为采血过程中红细胞破裂造成，红细胞释放的内源物质本身可能对检测造成影响，同时其内含的蛋白也无法区分于血清/血浆蛋白的检测。Olink官方在进行Panel验证时，严格进行了溶血干扰的测试，并计算获得了每种靶向蛋白的抗溶血干扰的范围，可用作参考。具体数据可见各检测panel性能验证报告的Endogenous interference列。