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N6-甲基腺嘌呤(m6A)修饰是真核生物mRNA中普遍的内部修饰,通常m6A修饰嵌入在5’-DRACH-3’(D=G/A/U,R=G/A,H=A/U/C)保守的共有序列中,而且主要富集在终止密码子区域,表明m6A修饰的分布特征可能具有重要的生物学功能。m6A RNA甲基化测序(MeRIP-seq)是以RNA免疫共沉淀为基础,采用特异抗体对发生m6A甲基化修饰的RNA片段进行富集后测序的技术手段,能够准确识别100-200个核苷酸区域的m6A修饰,在RNA表观遗传学领域被广泛采用。
技术路线:
技术优势:
•开放的全转录组分析:无需预先设计探针,无需预知mRNA甲基化位点信息;
•信息量大:在全转录组水平上获得mRNA和poly(A)+长非编码RNA的甲基化修饰区域信息;
•准确性高:以未经抗体富集的mRNA文库作为input对照,校正mRNA表达量的影响,获得准确可靠的甲基化区域信息。
样本类型:完整无基因组DNA污染的Total RNA
样本需求量:总量 ≥ 100 μg,浓度 ≥ 200 ng/μL
样本纯度:OD260/280 = 1.8~2.2,OD260/230 ≥ 2.0
样本完整度:Agilent 2100 Bioanalyzer 检测RIN值 ≥ 7.0,28S/18S ≥ 1.0
数据分析内容:
基础分析 1) 原始测序数据预处理 2) 数据质量过滤 3) 参考序列比对分析 4) mRNA表达定量分析 (基于Input文库) 5) 甲基化区域预测 6) 甲基化区域motif分析 7) 甲基化的转录本分布特征分析 8) 甲基化差异分析与基因注释 9) 甲基化差异基因GO富集分析 10) 甲基化差异基因KEGG富集分析 高级分析 mRNA表达与甲基化联合分析 |
结果展示:
图 样本reads分布的Fingerprints图
图 Peak在5'UTR、CDS和3'UTR区域内的分布
图 Peak在基因组各区域内的分布
Motif分析结果展示
图 Peak在不同样本中的可视化展示
Molecular Cancer:ALKBH5通过m6A修饰表观上抑制下游靶点LYPD1限制了肝细胞癌的恶性
作者首先应用dot blot检测了ALKBH5对m6A修饰的调节作用。ALKBH5的缺失导致Huh7和MHCC97H细胞中m6A水平明显升高,而过表达ALKBH5则产生相反的结果(图A)。
为了发现观察到的依赖ALKBH5表型的确切机制,作者利用稳定的ALKBH5过表达和载体转染的HCCLM3细胞(每组两个生物学重复),采用MeRIP-seq和RNA-seq相结合的方法。MeRIP-seq显示,当ALKBH5上调时,有1538个差异的m6A peaks丰度降低(1344个相应的转录本)。同时,RNA-seq发现了481个在ALKBH5过表达时下调的转录本。
作者更重视甲基化模式和表达水平受ALKBH5调控的癌基因。因此只选择那些在ALKBH5过表达时同时具有低的m6A peaks和表达降低的转录本进行后续研究(图B)。为了进一步缩小候选基因的范围,集中在重叠的前10个基因,即COCH、LYPD1、ADAMTS14、ABCA4、TP53I11、COLCA2、TMED7、CYP4F3、IL17RB和VCAN。在ALKBH5沉默或过表达的细胞中通过qPCR进行初步验证(图C)。有趣的是,在所有三种肝癌细胞中,只有LYPD1始终被ALKBH5负向调控(图D-G),western blot结果进一步证实了这一点(图H)。综上所述,LYPD1可能是ALKBH5的直接下游靶点。
图 LYPD1被确定为ALKBH5的候选靶点
1.IGV软件使用说明?
答:IGV软件可以通过http://software.broadinstitute.org/software/igv/download下载,通过将.tdf加载到IGV软件中即可直观的显示基因组各个区域的覆盖度和测序深度,以及重复样品的平行性和不同样品之间的差异。
IGV软件中包含了包括人、小鼠、大鼠等个物种不同版本的基因组草图,这里选择Mouse mm10参考基因组,选择特定的染色体或者All选项可以查看不同染色体上的覆盖度和测序深度,输入特定的染色体区域或者基因名称可以查看相应区域的比对情况,右侧的“+”“-”可以对特定的显示范围进行放大和缩小。界面主体显示不同样本在特定区域内的测序深度,Refseq genes一栏中显示对应区域的基因结构信息。
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