近日，来自大连理工大学环境科学与技术学院张耀斌教授团队，在国际知名期刊Chemical Engineering Journal（IF=13.2，1区Top）发表研究论文。大连理工大学王学朋为第一作者。该团队利用昊为泰（GeneCowin）AccuMetaG^®宏基因组绝对定量测序专利技术，首次系统揭示了黄孢原毛平革菌与间歇微好氧协同作用下，在厌氧体系中诱导活性氧生成并显著提升甲烷产量的分子机制。该成果不仅突破了传统“厌氧环境排氧”的理念，也展示了绝对定量技术在揭示复杂微生物生态功能中的独特优势，为提升生物沼气工程效率提供了新的理论依据与工程路径。

英文题目：Reactive oxygen species generation induced by coupling Phanerochaete chrysosporium with intermittent micro-aeration to enhance methane production

中文题目： 黄孢原毛平革菌与间歇微好氧协同诱导活性氧生成以促进厌氧消化产甲烷

发表期刊：Chemical Engineering Journal

影响因子： 13.2（一区Top期刊）

发表时间： 2025年7月25日

本研究内容概要图

1.绝对定量揭示关键功能基因真实变化。昊为泰宏基因组绝对定量测序技术量化了铁还原菌、产甲烷古菌及抗氧化酶基因（SOD、CAT、GPX等）的真实拷贝数，为解析氧化胁迫下的代谢适应机制提供数据支撑。

2.首次揭示黄孢原毛平革菌可在低氧厌氧环境下促进ROS生成。研究发现通过间歇性微好氧供气，系统氧化还原电位周期性波动，可触发•OH和H₂O₂生成，显著促进木质纤维素降解。

3.甲烷产量显著提高。真菌与间歇微好氧耦合系统（IMA-P组）较对照组甲烷累积产量提升26.36%，并提高总悬浮固体（TS）、挥发性固体（VS）去除率和底物降解稳定性。

4.建立“真菌–铁循环–微氧波动”协同产甲烷新模型。研究证实P. chrysosporium 在微氧–厌氧交替下仍能分泌木质素酶并生成ROS，通过Fenton样反应与Fe(II)/Fe(III)循环协同促进有机质降解。

昊为泰宏基因组绝对定量测序技术使研究者得以获得微生物功能基因的真实拷贝数，消除了相对定量引起的虚假变化，从而精准揭示了氧化还原波动下微生物功能基因的真实响应，是该研究成功解析真菌–微好氧–产甲烷耦合机制的关键。

本研究设置三个分组，每组3个重复，分别为：间歇微好氧组（IMA）、IMA＋P. chrysosporium耦合组（IMA-P）和无通气无真菌对照组（Control）。运行三个阶段（每阶段36天），开始阶段加100 mL消化液和350 mL 新鲜牛粪（6 % TS），并加 10 mM 水铁矿。IMA-P 仅在第 1 阶段初投2 g菌丝；对照与IMA投等量灭活菌丝。37°C静置培养，每日用注射器定量注空气。后续检测指标包括TS/VS、沼气量与成分、纤维素/半纤维素/木质素、氧化还原电位（ORP）、扫描电镜（SEM）、傅里叶红外（间歇微好氧组FTIR）、三维荧光（3D-EEM）、羟基自由基（•OH）、过氧化氢（H₂O₂）、漆酶/木质素过氧化物酶/锰过氧化物酶（Lac/LiP/MnP）、循环伏安法（CV）和电化学阻抗谱（EIS）分析等，微生物宏基因组绝对定量测序分析由上海昊为泰生物科技有限公司完成。

厌氧消化性能显著提升

研究者实验发现，在通气强度为8%（V_Aeration:V_Reactor）/day条件下，IMA组与IMA-P组的甲烷产量分别提升17.22%和26.36%，底物总固体（TS）去除率分别比对照组高出9.21和7.6个百分点。木质素、纤维素含量显著降低，SEM结果显示颗粒结构破碎更彻底（图1）。

图1. 厌氧消化性能。A）累积甲烷产量。B）消化前后TS与VS变化。C）处理后木质纤维素含量。D）各组污泥的扫描电镜图像。

氧化还原振荡与ROS生成机制

在8%供气条件下，氧化还原电位（ORP）在–460至–300 mV之间周期振荡，说明氧在系统内被微生物迅速消耗。IMA-P组中O₂下降速度更快，表明真菌促进氧利用。进一步检测发现，IMA-P组中H₂O₂浓度为24.19 μM，比IMA组高90.98%；•OH浓度为65.29 μM，比IMA组高82.18%。EPR信号强度及荧光探针法均证实真菌-微好氧耦合可显著增强ROS生成（图2）。

图2. 间歇微曝气后活性氧生成。A）H₂O₂浓度。B）•OH的EPR光谱。C）•OH累积含量。红星表示两组间显著差异（p<0.05）。（原文图3）

木质素降解酶活性增强

1小时供气后取样检测酶活。IMA-P组的漆酶（Lac）、锰过氧化物酶（MnP）、木质素过氧化物酶（LiP）活性分别比IMA组提高112.8%、424.1%和23.9%。这些酶共同氧化芳香结构并促进C–C、C–O键断裂，加速木质素裂解。研究表明这些酶与Fenton样反应协同，进一步促进ROS生成（图3）。

FTIR结果显示，IMA和IMA-P组在3400–3200 cm⁻¹（O–H伸缩）和1600 cm⁻¹（芳香环振动）处峰强增强，说明•OH攻击导致木质素键断裂。1650 cm⁻¹羰基峰增加表明醌类生成，有利于电子传递。3D-EEM显示富里酸与腐殖酸荧光增强，代表有机质向腐殖化方向转化，进一步表明木质纤维素结构变化与腐殖化增强。

图3. 木质素降解酶活性。A）漆酶活性。B）锰过氧化物酶活性。C）木质素过氧化物酶活性。红星表示两组间显著差异（p<0.05）。（原文图4）

电化学活性提升

循环伏安法（Cyclic voltammetry，CV）检测通过扫描电极电位记录氧化-还原电流，计算污泥电容，反映微生物胞外电子储存能力。电化学阻抗谱（EIS）分析通过在固定偏压下施加小振幅正弦交流信号，拟合电荷转移电阻，反映污泥内电子转移难易程度。上述检测结果表明，IMA-P组污泥电容较对照提高30.93%，阻抗下降53.93%，说明体系电子传递能力增强。真菌促进醌类物质生成，为微生物群体提供更多电子存储与传递通道（图4）。

图4. 微生物电活性变化。A）循环伏安曲线。B）电化学阻抗谱。（原文图6）

微生物群落动态变化与抗氧化机制

IMA-P组中P. chrysosporium在第一阶段（第36天）占比达42.96%，在第108天仍维持1.54%，可在8%供气条件下稳定繁殖, 证明适量供氧是其稳定定殖的关键（图5A）。铁还原菌（Geobacter、Shewanella、Desulfovibrio）绝对丰度比对照提升1.6倍，增强了Fe(III)/Fe(II)循环，说明 Fe(III) 不断再生，强化胞外呼吸链（图5B）。产甲烷菌Methanothrix与Methanospirillum绝对丰度分别提高1.47倍和1.33倍，表现出氧耐受性在 IMA中显著增强，与产气曲线吻合（图5C）。抗氧化基因（SOD、CAT、GPX等）绝对拷贝总数在IMA-P组为对照的1.57倍，说明体系具备ROS清除与耐氧防御能力（图5D）。

图5. A）IMA-P组真菌相对丰度动态。B）细菌绝对丰度分布。C）古菌绝对丰度。D）ROS清除酶功能基因绝对丰度。（原文图7）

本研究通过系统性揭示了P. chrysosporium与间歇微好氧耦合可在厌氧体系中诱导ROS生成，显著提升木质纤维素降解速率与甲烷产量。氧化还原振荡驱动Fe(III)/Fe(II)循环和Fenton样反应，促进有机底物裂解。本研究利用昊为泰宏基因组绝对定量测序专利技术，首次系统揭示了P. chrysosporium与间歇微好氧协同作用下，在厌氧体系中诱导活性氧生成并显著提升甲烷产量的分子机制，发现了耦合体系中富集的铁还原菌与具抗氧化能力的产甲烷古菌维持氧胁迫下的稳定产甲烷过程。该研究为优化微好氧–真菌协同的生物能转化提供了新思路，也为废弃物资源化提供了重要技术支撑。