近日，南京医科大学附属儿童医院肾脏科张爱华团队等合作在Advanced Science杂志（IF：14.1，中科院1区Top）发表新研究论文“HNF3α Targets Nckap1l and Promotes Renal Fibrosis Following Ischemia-Reperfusion Injury”，该研究阐明了HNF3α在IRI后肾纤维化中的作用及其机制。在该研究中，团队利用条件敲除HNF3α小鼠和静脉注射过表达HNF3α的质粒来改变小鼠肾组织中HNF3α的表达，构建IRI诱导的肾纤维化模型，评估胶原纤维沉积、纤维化相关分子和炎症因子，以确定HNF3α对肾纤维化的影响。还使用转录组测序和CUT&Tag测序（昊为泰提供服务）来鉴定HNF3α下游的潜在通路并阐明其机制。

 关于CUT&Tag测序 

CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）测序是研究蛋白质和DNA相互作用的新方法，通过将Protein A/G与Tn5转座酶融合，在目标蛋白特异性抗体的介导下，实现对蛋白结合区域附近DNA的切割和测序文库构建。与传统的ChIP-seq相比，CUT&Tag具有样本量要求低、实验周期短、灵敏度高等优势。

CUT&Tag技术在表观遗传学研究中有着广泛的应用和潜力，主要用于解析转录因子结合位点和组蛋白修饰的全基因组分布，探索染色质的三维结构及其功能。通过分析这些结合位点和修饰，可以揭示基因调控网络、表观遗传机制以及疾病发生的相关机制，为疾病研究和药物开发提供高效解决方案。

主要研究结果 

1.HNF3α在CKD患者和肾纤维化小鼠肾脏中表达上调

对20例CKD患者的肾活检标本和5例因肾癌行肾切除术患者肿瘤旁正常肾组织的对照标本进行HNF3α表达检测。免疫组化和免疫荧光染色等显示CKD患者中HNF3α表达显著上调，主要出现在肾小管上皮细胞中（图1a，c）。此外，HNF3α的表达与胶原纤维沉积、血清肌酐和血尿素氮水平呈显著正相关（图1b）。为了表征HNF3α在纤维化小鼠肾脏中的表达，团队建立了两种肾纤维化动物模型：单侧IRI和UUO。在单侧IRI模型中，免疫印迹和qPCR分析显示HNF3α显著升高（图1d-f）。此外，IRI模型的免疫组织化学结果与CKD患者的结果一致，在纤维化肾脏中，主要是在肾小管上皮细胞中HNF3α的表达增加（图1g）。在UUO小鼠模型中，结果也相似（图1h-j），这些小鼠也主要在肾小管上皮细胞中HNF3α的表达增加（图1k）。

图1 HNF3α在CKD患者和肾纤维化小鼠肾脏中表达上调

利用CRISPR/Cas9技术构建靶向敲除肾小管上皮细胞中HNF3α的小鼠（图2a），并进一步确认肾小管上皮细胞中HNF3α蛋白水平显著降低（图2b-d）。组织病理学分析显示，IRI小鼠肾小管萎缩，间质广泛炎症和浸润，胶原沉积，均为纤维化的标志（图2e）。而IRI-HNF3α CKO小鼠的各项指标明显降低（图2e-h）。采用ELISA法检测小鼠肾组织中TNFα、IL-1、IL-6、MCP-1的含量。结果显示，在IRI-HNF3α CKO小鼠中，四种炎症细胞因子的水平显著降低（图2i-1）。这些结果表明，小鼠肾小管上皮细胞HNF3α的缺失显著减轻了肾纤维化和IRI引发的炎症反应。

图2 HNF3α敲除减轻IRI小鼠肾纤维化

与上述实验类似，通过过表达质粒研究HNF3α过表达对IRI小鼠肾纤维化的影响。结果发现过表达后小鼠各项相关指标明显升高（图3a-h）。ELISA检测小鼠肾组织中4种炎症因子，发现在过表达组显著升高（图3i-1）。综上所述，这些研究结果表明，肾组织中HNF3α的过表达导致IRI后肾纤维化和炎症的显著加剧。

图3 HNF3α过表达加重IRI小鼠肾纤维化

3.HNF3α介导TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞促纤维化反应

为进一步阐明HNF3α在TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞促纤维化过程中的作用机制，利用小鼠肾近端小管细胞（TKPTS）进行了实验。TGF-β1刺激TKPTS可显著增加HNF3α的表达（图4a，b）。因此，用不同的HNF3α shRNAs或过表达质粒转染这些细胞，或者用HNF3α的抑制剂（±）-JQ1处理，然后用TGF-β1刺激24 h，继而检测纤维连接蛋白和胶原Ⅰ。免疫印迹表明，3种HNF3α shRNAs有效降低HNF3α的水平（图4c，d），因此用于后续实验。与载体处理组相比，含有HNF3α shRNAs的细胞中TGF-β1后，纤维连接蛋白和I型胶原水平明显降低（图4e，f）。用500 nM（±）-JQ1处理TKPTS细胞（降低了HNF3α蛋白的稳定性），对细胞活力没有不利影响（图4g），并导致HNF3α蛋白水平下降（图4h，i）。与接受TGF-β1+DMSO处理的细胞相比，这一处理还导致纤维连接蛋白和胶原I的表达显著降低（图4j，k），这表明下调或抑制HNF3α可减轻TGF-β1诱导的促纤维化反应。相反，相对于载体组，过表达HNF3α的TKPTS细胞在TGF-β1刺激后，纤维连接蛋白和胶原I水平升高（图4l-0），表明过表达HNF3α可促进TGF-β1在肾小管上皮细胞中的促纤维化作用。此外，当HNF3α过表达并加入TGF-β1时，(+)-JQ1抑制了HNF3α过表达引起的纤维连接蛋白表达增加（图4p，q）。

图4 HNF3α介导TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞促纤维化反应

4.HNF3α直接促进Nckap1l的转录

为探究HNF3α促进肾纤维化的机制，将HNF3α过表达质粒或对照质粒转染TKPTS细胞，并进行转录组测序。通过分析，鉴定出41个表达降低的基因，91个表达升高的基因（图5a）。利用CUT&Tag测序对HNF3α基因的全基因组靶点进行分析，鉴定出35765个峰，对应8692个RefSeq基因（图5b-d）。大多数HNF3α的峰位于转录起始位点附近（图5c）。接下来，结合CUT&Tag数据对RNA-seq进行分析，以确定HNF3α过表达的细胞中差异表达基因之间的相似性。结果显示，HNF3α靶基因中有31个基因上调，12个基因下调（图5e）。在这些基因中，Nckap1l显著上调（图5e）。该基因编码Nckap1l蛋白，该蛋白是WAVE蛋白复合物的一部分，通过与Rac信号通路的相互作用，在F-actin细胞骨架组装中起关键作用，并影响细胞粘附和迁移。q-PCR分析证实，HNF3α在TKPTS细胞中的过表达导致Nckap1l的转录显著增加（图5f），免疫印迹也证实了这一点（图5g，h）。相反，HNF3α表达降低导致Nckap1l蛋白水平降低（图5i，j）。同样，对敲除肾小管上皮细胞HNF3α的小鼠模型的分析显示，相对于对照组，敲除组的Nckap1l水平显著降低（图5k，1）。免疫组化和免疫荧光也对Nckap1l水平进行了检测（图5m）。

团队还使用生物信息学软件JASPAR（http://www.jaspar.genereg.net/）鉴定了Nckap1l启动子中潜在的HNF3α结合位点。因此，染色质免疫沉淀实验表明，在Nckap1l转录起始位点上游存在HNF3α的潜在结合位点，表明HNF3α直接调控该基因的表达（图5n-p）。此外，还构建了一个Nckap1l启动子质粒，然后利用双荧光素酶报告基因检测。结果显示，HNF3α导致萤火虫/海肾荧光显著增加，但加入突变体Nckap1l启动子质粒后，萤火虫/海肾荧光没有增加（图5q）。在CKD患者和TKPTS细胞中，免疫荧光检测HNF3α和Nckap1l均显示共定位（图5r，s）。这些研究结果表明，HNF3α在肾小管上皮细胞中作为Nckap1l转录的启动子具有关键作用，并提示Nckap1l参与IRI后肾纤维化的进展。

图5 HNF3α直接促进Nckap1l的转录

5.CKD患者及肾纤维化小鼠中Nckap1l表达上调

免疫组化结果显示，CKD患者肾脏（主要在肾小管内）NCKAP1L表达增加。NCKAP1L表达的增加也与胶原纤维沉积等水平呈正相关，表明与肾纤维化有关（图6a，b）。然后检测了单侧IRI小鼠，免疫印迹和q-PCR结果证实了Nckap1l蛋白和Nckap1l mRNA的显著上调（图6c-e），免疫组化显示Nckap1l主要存在于纤维化肾小管中（图6f）。UUO小鼠模型的结果与此相似，在蛋白质和mRNA水平上，这些小鼠的该基因显著升高，免疫组化结果相似（图6g-i）。进一步分析来自GEO数据库的RNA-seq数据集GSE175759，该数据集由来自32名CKD患者和15名对照组的样本组成，也显示CKD患者中NCKAP1L显著上调（图6k）。Nckap1l和LTL的免疫荧光染色显示CKD患者中Nckap1l的表达明显上调，主要在小管上皮细胞中（图6l）。因此，人类CKD患者和小鼠肾纤维化模型中Nckap1l的上调表明该蛋白在CKD发病机制中的重要性。

图6 CKD患者及肾纤维化小鼠中Nckap1l表达上调

6.Nckap1l过表达加重IRI诱导的小鼠肾纤维化

团队设计了一个Nckap1l慢病毒过表达载体，并将其直接注入小鼠肾皮质，然后在7天后建立IRI模型。免疫印迹显示外源性Flag-tag的存在以及肾组织内Nckap1l蛋白水平的显著升高（图7c，d），表明成功建立了Nckap1l过表达小鼠。此外，与之前的观察结果相似，IRI后2周的肾脏组织化学根据PAS、HE和MASSON染色显示明显的纤维化（图7a）。Sirius Red染色显示，与对照组相比，Nckap1l过表达组胶原纤维沉积明显增加（图7a，b）。免疫组化分析还显示，与对照组相比，Nckap1l过表达组的纤维连接蛋白、α-SMA、I型胶原、F4/80-阳性巨噬细胞和CD86-阳性M1巨噬细胞的水平明显升高（图7a，b）。免疫印迹结果显示，Nckap1l过表达组中纤维连接蛋白、α-SMA、I型胶原和CD86水平升高，但CD206水平无差异（图7c，d）。同样，ELISA检测结果显示，与对照组相比，Nckap1l过表达组的TNFα、IL-1、IL-1、IL-6、MCP-1水平升高（图7e-h）。这些结果表明，肾脏中Nckap1l的过表达显著加重了肾脏纤维化，并导致IRI后间质炎症细胞浸润增加和肾脏整体炎症。

图7 Nckap1l过表达加重IRI诱导的小鼠肾纤维化

7.Nckap1l促进TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞的促纤维化反应和细胞迁移

用TGF-β1刺激TKPTS也导致Nckap1l的表达显著增加（图8a，b）。因此，用不同的Nckap1l siRNAs转染这些细胞，然后TGF-β1刺激，并检测纤维连接蛋白和胶原蛋白Ⅰ。免疫印迹表明，3种Nckap1l siRNAs可以有效降低Nckap1l的水平（图8c，d），因此使用它们进行后续实验。值得注意的是，与用载体处理相比，含有Nckap1l siRNAs的细胞的TGF-β1刺激显著降低了纤维连接蛋白和胶原I的水平（图8e，f）。然后利用Nckap1l慢病毒载体进行过表达研究，检测Nckap1l对TGF-β1诱导的促纤维化反应和细胞迁移的影响（图8g-i）。免疫印迹显示，相对于TGF-β1+Vehi组，TGF-β1+Nckap1l组纤维连接蛋白和I型胶原明显升高（图8j，k）。免疫印迹结果显示TGF-β1+HNF3α CKO组纤维连接蛋白水平较对照组降低，TGF-β1+Nckap1l组纤维连接蛋白水平较对照组升高。有意思的是，在缺乏Hnf3α的情况下，Nckap1l的过表达伴随着TGF-β1刺激可恢复纤维连接蛋白表达的增加（图8l-o）。这些结果表明，Nckap1l过表达增强了TGF-β1在肾小管上皮细胞中诱导的促纤维化反应。而当HNF3α的过表达并加入Nckap1l siRNAs和TGF-β1时，免疫印迹结果显示TGF-β1+HNF3α组的纤维连接蛋白水平较对照组升高，而TGF-β1+ Nckap1l siRNA组的纤维连接蛋白水平较对照组降低。有趣的是，在HNF3α的过表达中，伴随着Nckap1l的下调和TGF-β1的刺激导致纤维连接蛋白的表达降低（图8p-s）。这些结果表明，Nckap1l在HNF3α的下游具有重要的功能。

此外，当过表达HNF3α或Nckap1l时，细胞迁移实验和细胞划痕实验也显示细胞迁移增强(图8t，u)，HNF3α CKO中细胞迁移下降（图8v），提示HNF3α和Nckap1l积极促进肾小管上皮细胞迁移。图8 Nckap1l促进TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞的促纤维化反应和细胞迁移。

图8 Nckap1l促进TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞的促纤维化反应和细胞迁移

 总结