近日，温州医科大学公共卫生学院祝建洪团队联合温州医科大学附属第二医院神经内科张雄、王建勇（共同一作）团队于Age and Ageing杂志（IF：6，JCR Q1）发表新研究成果“Detection of early Parkinson’s disease using 5-hydroxymethylcytosine episignatures in blood DNA”，利用全基因组羟甲基化测序及目的区域羟甲基化测序证实了5hmC表观特征可以用于PD早期诊断。

值得一提的是，昊为泰参与了本研究中的全基因组及目的区域羟甲基化测序服务，采用的基于APOBEC酶反应方法（ACE-seq）进行建库，该方法具有如下技术优势：1、无需亚硫酸氢盐处理，减少基因组DNA损失，适用于低起始量的样本；2、可在单碱基分辨率条件下进行5hmC的检测定位，能够实现全基因组或目的基因5hmC检测；3、准确性高，仅需一个文库即可进行5hmC检测，性价比优。

1.血液DNA中单碱基分辨率的差异羟甲基化位点分析

在第一阶段全基因组5hmC测序中，共纳入了5例PD患者及5例相应对照，全基因组中5hmC的水平会因胞嘧啶的成分而显著改变，其中CG位点的占比高（0.85%），而CHG和CHH位点的占比分别为0.15%和0.21%，这与在CG位点优先发生羟甲基化的现象相一致（图1a）。总共检测了368,389,975个胞嘧啶（5hmC）位点（6.8% CG，24.5% CHG及68.7% CHH），包括13,618个差异5hmC位点（DhmCs，56.7% CG，7.1% CHG及36.1% CHH，图1b, c）。DhmCs的分布在基因组元件上显著不同，主要发现于内含子和基因间区域（图1d）。86个PD风险基因的列表中有29个携带DhmCs（图1e）。

图1a-e PD血液样本中全基因组DhmC

2.血液DNA中差异羟甲基化区域分析

共识别出135,346个符合预设标准的区域，其中患者的CG羟甲基化水平略有升高（图1f）。经过阈值筛选，保留了523个差异羟甲基化区域（DhmRs，图1g, h）。两个PD风险基因被涉及：ITPKB在外显子中具有高DhmR水平，而FAM49B在内含子中具有低DhmR水平（图1h）。GO分析显示，高DhmRs富集在GTP酶调节活性和氧化应激反应相关生物学过程，而低DhmRs富集在脂质磷酸化相关过程中（图1i）。

图1f-i PD血液样本中全基因组DhmR

3.整合DhmCs和DhmRs及基因表达分析

由于基因body区及邻近上游区域的DNA 羟甲基化与基因表达相关，团队利用公共数据GSE99039（包含205名特发性PD患者和233名对照）分析了全血中基因表达水平。差异分析确定了1045个差异表达基因（DEGs，937个上调基因和108个下调基因；图2a）。交集显示549个DhmC相关的基因存在差异表达，其中主要位于内含子区域（图2b）。这些基因的GO富集分析突出了免疫相关过程，例如免疫效应过程的调节（图2c）。同样，与DEGs重叠的DhmR相关基因有79个（图2d和e），其富集与免疫过程相关，例如巨噬细胞细胞因子产生的调节（图2f）。

图2 血液样本中差异基因与DhmCs/DhmRs相关基因交集分析

4.第二阶段目的基因区域羟甲基化验证

17个第一阶段的DhmRs被严格筛选（p < 0.001，绝对5hmC差异> 0.05）进行进一步的目的区域羟甲基化验证分析（图3a和b），其中16个区域能够被成功测序，共纳入了78例PD患者及82例对照。大多数区域差异与第一阶段相似（图3c）。这些区域中，R1/R3/R5和R10在PD中显示出显著的羟甲基化改变（图3c）。然而，这四个区域在第二阶段样本的诊断效力较差，ROC分析显示训练集和测试集中AUC分别为0.756及0.738（图3d）。

图3 第二阶段羟甲基化验证及DhmRs用于PD诊断分析

5.第二阶段DhmCs用于构建PD诊断模型

在16个靶向区域中，502个胞嘧啶位点被分析。逻辑回归分析发现10个DhmCs在整个PD队列中，17个在早期PD患者中（倍数> 1.8，p < 0.05，图4a和c）。整个PD队列中10个DhmCs位于R1/R3/R6/R7/R10和R12的区域中（图4b），而早期PD的17个DhmCs位于R1-R3/R6/R7/R9/R10及R12-R14的区域中（图4d），8个位点在两组中是相同的。

整个PD队列中终模型（由5个DhmCs和年龄组成）在训练集和测试集中AUC分别为0.838及0.887，然而模型的灵敏度低于80%（图4e）。作为对比，在早期PD诊断中，9个DhmCs和年龄的模型在训练集和测试集中AUC分别为0.923及0.923，其准确性、灵敏度、特异性和精确性均超过80%（图4f）。

图4第二阶段DhmCs用于PD诊断分析

6.对DhmC panel与临床特征的回顾性分析

团队研究了上述早期PD DhmC panel与临床特征（包括运动表现和病程）之间的关系。小提琴图分析表明，早期PD panel的DhmC水平在对照组、早期和晚期PD患者之间存在显著差异（图5a）。特别地，该panel能够清晰地区分早期PD患者与对照组，并进一步在早期PD患者中区分出TD和nTD亚型（图5b）。ROC分析表明，早期PD panel能够区分早期（H-Y≤ 2）和晚期（H-Y> 2）患者（AUC为0.839，图5c和d）。此外，基于早期panel的预测值与MDS-UDPRS II 评分（运动检查部分）和MDS-UDPRS总分显示出中等程度的相关性（两者r > 0.40且 p < 0.01；图5e和f），与病程（r < 0.40；图5g）也显示出轻微的相关性。然而，由于个体患者用药情况的不同，无法在药物治疗的背景下进行分析。相比之下，总PD panel的DhmC水平无法区分对照组和PD亚组（图5h和i）。基于总PD panel的预测值仅与临床评分和病程显示出较弱的相关性（r < 0.40；图5j-l）。

图5 早期和总PD panel DhmCs与临床特征的分析

这项研究是首次对帕金森病患者血液DNA中的5hmC的全基因组范围的改变进行了记录，并引入了一种基于血液中5hmC特征的早期帕金森病诊断检测模型。这项发现为帕金森病相关的表观遗传变化提供了新的见解，并突显了这些生物标志物在提高诊断准确性方面的临床潜力。

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