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转录组测序+SSR鉴定,文章可以轻松发


原创 上海天昊生物 
 
转录组测序完后,很多老师最关心的就是样本中差异表达的基因有哪些,涉及到哪些生物功能及代谢通路等。然而对于一些物种样本而言,在转录组测序基础上,进一步开发SSR分子标记,深入挖掘物种中的遗传多样性等信息,可以从另一个角度快速成文,今天小编就跟大家分享一篇近期发表的经典范例。
 

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题目:The development of SSR markers based on RNA-sequencing and its validation between and within Carex L. species
基于RNA测序的SSR标记的开发及其在苔草种间和种内的验证
发表期刊:BMC Plant Biol.   
发表时间:2021-1-6  
影响因子:3.497

 

 

研究摘要

 

苔草属(Carex L.)是莎草科最大的属之一,也是生态系统中重要的维管植物。但苔草的遗传背景复杂,分类不明确。为了研究苔草的基因功能注释,进行了RNA-seq分析。根据Illumina的测序数据生成SSR,然后用于研究79份苔草种质的遗传特性。在本研究中,共获得36,403个单基因,总长度为41,724,615 bp,并基于GOKOGKEGGNR数据库进行注释。在8776SSR中,随机选择了96对引物。42对多态性较高的引物共扩增出180条多态性带。每个引物的平均条带数为4.3,平均距离值为0.548,多态信息含量为0.133-0.494。观察到的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)Nei's基因多样性(H)Shannon信息指数分别为2.0001.3760.2430.391NJ聚类分为三组,来自新西兰的材料表现出相似的遗传属性,聚类成一组。UPGMAPCoA分析也显示了相同的结果。AMOVA分析表明,基于地理起源聚类和NJ聚类的种内遗传多样性优于种间遗传多样性。此外,本研究还建立了79种苔草的指纹图谱。引物对的不同组合可以一次鉴定多种苔草,克服了传统鉴定方法的困难。转录组分析从基因注释中揭示了新的功能类别。遗传特征分析表明,79种苔草属植物间存在广泛的基因流动。这些标记可用于调查苔草和相关物种的进化史,以及作为未来育种项目的指南。

 

 

研究方法

 

使用HiSeq2000平台进行转录组测序,利用TRINITY、TGICL等软件进行从头组装和功能注释,使用MISA和Primer等软件SSR的鉴定和引物设计,用POPGENE进行遗传多样性分析,使用NTSYS、PowerMarke、MEGA和GenAlEx等软件对79份材料进行聚类分析和AMOVA等分析。

 

 

研究结果

 
RNA-seq及从头组装
使用HiSeq2000平台对青绿苔草的转录组进行测序。总共获得了43.67Gb的数据。每个样本的数据达到6.32GbQ30百分比超过94.03%。总共有36,403个单基因,其中12,657个单基因的长度超过1 kb。单基因的N502016,表明具有很高的组装完整性。
 
基于不同数据库的基因注释
根据序列的同源性分析,将11,629个单基因(31.95%)分为三个主要的GO类和50个子类。根据KOG数据库,将11,871个单基因分为25个功能组,并将20.52%的单基因注释为“一般功能”群。基于KEGG数据库,总共发现了8440个单基因,包括属于五个大类(细胞过程,遗传信息处理,环境信息处理,代谢和生物系统)的40条生物途径(图1)。



1、基于GOKOGKEGG数据库的基因标注结果。

 

基于NCBI非冗余核苷酸数据库,E值分布显示有23.00%的单基因搜索到结果(2a),约35.00%的单基因表现出大于80%的同一性(2b)NR蛋白序列比对结果显示,21.69%可与菠萝属植物比对,10.10%可与杜鹃花属植物比对,8.03%可与凤凰属植物比对(2c)



 

2、青绿苔草unigene同源性检索及非冗余蛋白数据库(Nr)特征分析。

 

转录组中SSR的频率和分布
使用MISA软件共扫描了36,403个单基因,检测到8776SSR位点(1)。转录组中的SSR位点有六种类型,每种重复类型的数量差异很大。



3、转录组数据集中鉴定的SSR类型分布。

 

SSR的开发及评价
我们设计并合成了96对引物来扩增11个表型差异材料,其中42(43.75%)可扩增多条条带,多态性高。引物表明不同苔草属物种之间具有良好的可转移性。未扩增条带数占15.6%,其余多态性较低或无多态性。
 
遗传多样性统计
42SSR中,我们识别了79份材料中的180个标记等位基因。42SSR中,PIC值在0.133 ~ 0.494之间,平均为0.259SSR在不同材料间表现出较大的遗传变异。采用聚类分析、主成分分析对苔草材料间的遗传多样性进行了研究。平均每个引物扩增出4.3条引物。观察到的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)Nei(1973)基因多样性(H)Shannon信息指数(I)分别为2.0001.3760.2430.391,表明苔草种间的遗传多样性较高。
 
基于SSR标记的苔草属植物聚类分析
为了揭示苔草属物种的分类信息,我们根据原始数据获得了等位基因频率。我们使用NJPCoAUPGMA聚类分析,而不是使用种源或分类等先验分类,并结合这些结果来探索所有材料的遗传信息和分类。
 
主坐标分析(PCoA)结果得到了两组遗传分化的苔草属材料(4)。第一主成分占29.6%,第二主成分占19.8%



 

4、苔草属79种样本的PCoA分析。第一主成分占29.6%,第二主成分占19.8%。红色菱形代表中国的种质资源,绿色正方形代表新西兰的种质资源,蓝色三角形代表北美的种质资源,黄色圆圈代表德国的种质资源。

 

基于Shered等位基因距离计算方法,NJ系统发育分析将79份苔草属植物资源分为3(5)



 

579份苔草属植物的系统发育树。NJ树包括三个主要簇,其中第一组(22)为蓝色,第二组(24)为绿色,第三组(33)为红色。

 

SSR原始数据的基础上,采用Dice系数法计算相似度。采用UPGMA法对79份材料进行聚类分析(6)。基因型间的相似度为0.070 ~ 0.786。通过UPGMA聚类,将79份种质资源分为两大类。关于苔草的收集来源,中国与新西兰、德国和北美的苔草种质之间存在一定程度的基因交换。然而,总的来说,资源不能完全按地区分配。相关系数r = 0.941,表明聚类结果可靠。



 

679份苔草的聚类分析。

 

为了评估这些种质之间的遗传差异,我们计算了所有材料对之间的FST值。通过不同来源的分析,AMOVA表明79份材料的总遗传变异中88%在群体内,12%在群体间。AMOVA分析结果显示,部分亚种在国家间存在较大差异,这与上述不同国家材料的结果一致。而基于NJ聚类分析的AMOVA分析结果显示89%在人群内(2)

279份苔草的AMOVA分析。



 

 

 

结论

 
转录组分析为注释基因的功能分类提供了新的思路,并将有助于未来基因功能研究。遗传背景分析表明,基因流在79苔草物种中广泛存在。这些标记物可用于评估遗传多样性,并研究苔草和相关物种的进化史,以及在将来的育种项目中提供指导。
 

 
 
 

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