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【昊阅读】甲基化芯片组学筛查后,到底怎么验证?

 


原创 上海天昊生物 
相信不少研究表观遗传学的小伙伴在进行甲基化组学芯片筛查后,都面临一个艰难选择,到底选什么位点去验证呢?
其实很多已发表文章都为大家提供了答案。
今天小编就来带大家读读几篇甲基化研究文章(部分是天昊客户的文章),看看候选位点的筛选有哪些策略可以让我们参考。



英文题目:
Genome-wide DNA methylation analysis in systemic sclerosis reveals
hypomethylation of interferon-associated genes in CD4+ and CD8+ T cells
中文题目:全基因组DNA甲基化研究发现系统性硬化症患者CD4+ 和CD8+ T细胞的干扰素相关基因表现低甲基化状态
期刊名:《J Invest Dermatol.》    
发表时间:2017年12月05日    
影响因子:7.143
单位:上海复旦大学生科院王久存教授课题组
 
  • 研究方法:


图片

 

  • 甲基化候选位点的筛选方式

1)针对芯片检测获得的差异甲基化位点,进行通路富集分析,发现type I IFN signaling pathway 2种细胞类型中都显著富集: CD4+ (P = 7.59 × 10-6); CD8+ (P = 2.10 × 10-8)


 
2)在通路中基于P值和基因功能,筛选了16个基因,对对应的62个差异甲基化位点进行大样本验证。
3)基于这62个差异甲基化位点进行目标区域扩增和目的区域甲基化二代测序(天昊Methyltarget检测)大样本验证,其中57个位点成功被检测,同时二代测序又获得了周围154个CpG位点的甲基化数据。验证成功的位点集中在5个IFN相关基因。
4)因为有57个位点既采取了芯片检测,又进行了基于二代测序的Methyltarget验证,因此针对overlap样本进行了技术一致性分析,R2值达到0.88.



 

5)针对5个验证成功的基因进行甲基化-mRNA表达水平验证,基因的甲基化水平为基因上所有CpG甲基化水平的第一主成分。
6) 针对5个验证成功的基因,进行甲基化、表达与血清 type I IFN-a/b 蛋白水平的关联分析



英文题目:
Rheumatoid arthritis–associated DNA methylation sites in peripheral blood mononuclear cells
中文题目:外周血单核细胞中类风湿性关节炎相关的DNA甲基化位点
期刊名:Annals of the Rheumatic Diseases    
发表时间:2017年12月05日    
影响因子:16.102
单位:苏州大学
 
  • 研究方法


 

  • 甲基化候选位点的筛选方式

1)甲基化芯片共鉴定了1046 个差异甲基化位点 (DMPs) (|Δβ|>0.05 + p<0.05), 其中730 个DMPs 位于598个基因。
2)在这598个基因中,445个基因 (覆盖 540 DMPs) 有表达数据。相关性分析得出,有107个DMP和 91个基因的表达水平存在相关性 (p<0.05) (正相关:负相关=44:63). 其中的67个基因 (覆盖81DMPs)在组间存在差异表达(p<0.05)。
3)针对上文提到的445个DMGs,,分别进行基于STRING的蛋白互作分析,在91个 DMGs 和67 个 DMGs 的互作分析结果中,都检测到了interferon-inducible gene interaction subnetwork这一网络(下图A). 进一步基于Cytoscape,针对81个DMPs和67个相应的基因mRNA的表达数据进行共表达整合网络分析,确定了5个亚网络(其中b4,b5同时包括了甲基化和表达数据)。基于这部分分析,鉴定了几个hub gene:MX1, IFI44L, DTX3L and PARP9


 
4)基于上述结果,选择10个DMGs:PARP9, IFI44L, MX1, ISG15, FAM8A1, STK17A, BLK, CNPY1, CBX7and SLC7A14 进行差异甲基化和差异表达的独立样本验证。选择条件为:(ⅰ) DMP位于启动子, (ⅱ) DMP的甲基化水平与基因表达水平显著相关, (ⅲ) DMP 上下游300bp的CpG位点丰富 (如:目标区域至少有3个CpG位点), (ⅳ) 基因属于通路分析中鉴定出来的优先选择.
5)针对10DMG,共检测了15DNA片段(100–300 bp) 5个在独立样本验证成功的DMPs ,有三个位于PARP9基因(cg00959259, cg08122652, cg22930808) 10个基因在独立样本中,有6个存在差异表达,其中4个基因和发现阶段趋势也一致(BLK, IFI44L, MX1 and PARP9)
6)后续选定PARP9基因进行后面的功能验证。


Nat Commun (IF: 12.121). 2017 Feb 1;8:14053. doi:10.1038/ncomms14053.HOPX Hypermethylation Promotes Metastasis via Activating SNAIL Transcription in Nasopharyngeal Carcinoma
 
  • 研究方法:


 
  • 甲基化候选位点的筛选方式

1)确定差异DMP和关注的基因: P<0.05 and Δβ change ≥|0.2|。只选择转录因子启动子区(TSS and 5′-UTR)的CpG位点进行分析,TFs的查询网站 (http://www.bioguo.org/AnimalTFDB/)
2)在344 TFs 中确定1,984 个差异CpG sites。其中 HOPX (cg21899596) 为甲基化水平改变最大的cpg位点。


 
3)独立样本验证HOPX 基因启动子区的CpG岛区甲基化情况(下图为验证区域),确定HOPX 基因启动子在癌组织和癌症细胞系中都高甲基化。


 
4)  验证表达水平和HOPX 基因启动子区甲基化的相关性。
5) HOPX 基因的功能研究。


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