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16S扩增子+粪菌移植解析肠道微生物与术后谵妄的关系


英文题目: Abnormal composition of gut microbiota contributes to delirium‐like behaviors after abdominal surgery in mice
中文题目:小鼠腹部手术后肠道微生物群组成异常导致谵妄行为
期刊名:CNS Neurosci Ther.
影响因子: 3.394
发表时间:2019年
研究目的:
    麻醉和手术可导致术后谵妄症状。越来越多的证据表明,肠道微生物群是大脑的生理调节器。在此,我们研究肠道微生物是否在术后谵妄(POD)中起作用。
研究方法
    应用层次聚类分析法对小鼠腹部手术后进行行为学检测,将其分为非POD表型和POD表型。收集粪便样本,进行16S扩增子测序,以检测虚假手术小鼠、非POD小鼠和POD小鼠肠道微生物组成的差异。将来自非POD和POD小鼠的粪便菌群移植到抗生素诱导的无菌小鼠体内,研究其对行为的影响。
动物
    71只C57BL/6J雄性小鼠,8周龄,体重约25克,并免费提供食物和水。所有实验方案均按照美国国立卫生研究院的指导方针和规定执行。实验方案经同济医学院动物实验委员会批准。
麻醉与腹部手术
    将小鼠随机分为麻醉+手术组(A+S组)和虚假手术组。
行为测试
    在研究开始前1周,将小鼠单独置于受控条件下(温度22±2°C;相对湿度55±10%;光/暗循环12小时),以适应新环境。麻醉和手术前24小时,采用旷场实验(OFT)、高架十字迷宫试验(EPMT)和埋藏食物小球实验(BFT)测定小鼠的基本行为。这些测试在麻醉和手术后6小时重复进行。在进行试验前,将小鼠置于试验环境中1小时,并在完成试验后返回各自的笼子。
16S扩增子测序分析
    在所有行为测试后收集粪便样本(图1A),然后进行细菌16S扩增子测序(V3-V4)。
无菌小鼠模型制备
    制备了无菌小鼠,25种广谱抗生素(氨苄青霉素1g/L,硫酸新霉素1g/L,甲硝唑1g/L)溶于饮用水中,连续14天随意给予C57BL/6小鼠,每两天更新一次饮用液。
粪菌移植
    老鼠被放在一个干净的笼子里,笼子里有消毒过的滤纸。大便后立即用无菌离心管收集粪便样本。每只老鼠的滤纸都换了。在分析和移植之前,将样品储存在-80°C冰箱中。粪便微生物群的制备方法是将从POD或非POD小鼠获得的1g粪便样品稀释在10mL无菌磷酸盐缓冲盐水中,将粪便悬浮,并通过灌胃将0.2mL悬浮液导入每个小鼠受体14天。
研究结果
    α-多样性和β-多样性表明非POD和POD小鼠肠道微生物组成存在差异。在门水平上,非POD小鼠体内的柔膜菌门Tenericutes含量显著高于POD小鼠,而在POD小鼠中没有发现Tenericutes。在纲水平上,POD小鼠体内的γ-变形菌Gammaproteobacteria水平较高,而非POD小鼠体内的柔膜細菌目Mollicutes水平明显较高,而POD小鼠体内没有检测到Mollicutes。POD小鼠和非POD小鼠共有20种肠道细菌存在显著差异。有趣的是,这些无菌小鼠在移植前表现出异常行为,接受非POD小鼠粪菌移植的无菌小鼠表现出行为改善,接受POD小鼠粪菌移植的无菌小鼠行为则不能改善。因此腹部手术后肠道菌群组成异常可能与POD的发生有关,针对肠道微生物群的治疗策略可以为POD治疗提供一种新的替代方法。
麻醉与腹部手术对体重及行为测试的影响
    首先,进行分层聚类分析(Ward's method),将麻醉和腹部手术后的小鼠分为三类:POD敏感、POD不敏感和未确定(图1B)。行为结果用z评分标准化,19只小鼠中有6只表现出POD样表型,而7只表现出非POD样表型,其它的被认为是POD未确定。
接下来,我们比较了虚假手术组、非POD组和POD组的体重和行为测试结果,包括旷场实验(OFT)、高架十字迷宫试验(EPMT)和埋藏食物小球实验(BFT)(图1C)。三组间体重无明显变化。在旷场实验(OFT)(图1D-F)中,与非POD组相比,POD组小鼠的中心交叉、中心持续时间和区域交叉显著增加,而非POD组和虚假手术小鼠之间没有差异。与非POD和虚假手术小鼠相比,POD小鼠的开放臂进入显著增加,但非POD组和虚假手术小鼠之间没有差异(图1G)。此外,在埋藏食物小球实验(BFT)中,与虚假手术小鼠和非POD小鼠相比相比,POD小鼠的进食潜伏期显著降低(图1H)。


 
 
图1 时间表和行为测试。A、 学习时间表。行为测试,包括旷场实验(OFT)、高架十字迷宫试验(EPMT)和埋藏食物小球实验(BFT)。B、树状图的层次聚类分析。C、体重(单因素方差分析)。D、中心交叉(单因素方差分析)。E、中心时间(单因素方差分析)。F、区域交叉(单因素方差分析)。G、开放臂进入(单因素方差分析)。H、寻找食物颗粒的潜伏期(单因素方差分析)。

虚假组、非POD组和POD组肠道菌群组成比较
    热图表明非POD组和POD组之间的肠道微生物群组成完全不同(图2A)。我们发现,与非POD组相比,POD组小鼠显著降低了Chao 1、Shannon、Simpson指数和PD指数,而虚假手术组和非POD组小鼠之间的α多样性指数没有变化(图2B-E)。除了α-多样性,β-多样性也是评估微生物群组成的一个参数。PCoA分析图显示,虚假手术组的点接近非POD组,最重要的是,POD组的点远离非POD组的点(图2F)。此外,与非POD小鼠相比,POD小鼠显著降低了PCA(PC1)评分(图2G)。总体而言,这些发现表明POD和非POD小鼠肠道微生物群组成存在差异,POD和非POD小鼠肠道细菌的数量和类型完全不同。
 

 
 
图2 各组之间肠道微生物群分布的差异。A、不同组别细菌热图,Y轴:OTUs;X轴:不同组别;a:虚假组;B:非POD组;C:POD组。B、Chao 1指数。C、Shannon指数。D、Simpson指数。E、PD指数。F、肠道细菌数据的PCoA分析。G、 肠道细菌数据的PCA分析。

门水平肠道菌群组成的变化
    图3显示了门水平肠道菌群组成的相对丰度图(图3A)。Fisher's检验显示三组间Tenericutes有显著变化(图3B)。与非POD小鼠相比,POD小鼠Tenericutes含量显著降低。
 

 
 
图3 门水平肠道微生物群组成的变化。A、 门水平相对丰度图。B、 Tenericutes水平(Fisher检验)。

纲水平肠道菌群组成的变化
    图4显示了纲水平上肠道微生物群组成的相对丰度图(图4A)。3组间的γ-变形杆菌和软体动物的水平有显著变化。我们发现POD小鼠的γ-变形杆菌水平显著升高,但POD小鼠的肠道中未检测到软体动物(图4B,C)。
 

 
 
图4 纲水平肠道微生物群组成的变化。A、 纲水平细菌相对丰度图。B、 γ-变形杆菌水平(Fisher检验)。C、 软体动物水平(Fisher检验)

目水平肠道菌群组成的变化
    图5显示了目水平上肠道微生物群组成的相对丰度图(图5A)。3组间的双歧杆菌和厌氧菌的水平有显著变化。有趣的是,与非POD小鼠相比,POD小鼠的双歧杆菌和厌氧菌水平显著降低(图5B,C)。
 

 
 
图5 肠道菌群组成在目水平上的变化。A、目水平肠道菌群相对丰度图。B、双歧杆菌水平(Fisher检验)。C、 厌氧菌水平(Fisher检验)

科水平肠道菌群组成的变化
    图6显示了科水平上肠道微生物群组成的相对丰度图(图6A)。3组间的Rikenellaceae水平有显著变化。进一步的分析表明,与虚假手术鼠和非POD鼠相比,POD鼠体内的Rikenellaceae含量显著增加(图6B)。有趣的是,梭状芽孢杆菌科1在假POD和非POD小鼠中没有检测到,但在POD小鼠中检测到(图6C)。此外,结果表明,与非POD小鼠相比,POD小鼠显著降低了Family XIII和瘤胃球菌科的水平(图6D,E)。此外,Anaeroplasmataceae的水平也发生了显著的变化,并且在POD小鼠的粪便样本中未检测到Anaeroplasmataceae(图6F)。
 

 
 
图6 科水平肠道微生物群组成的变化。A、科水平细菌相对丰度图。B、 Rikenellaceae(单因素方差分析)。C、 梭菌科1(Fisher检验)。D、Family XIII(单因素方差分析)。E、瘤球菌科(单因素方差分析)。F、Anaeroplasmataceae(Fisher检验)。

属水平肠道菌群组成的变化
    图7显示了属水平上肠道微生物群组成的相对丰度图(图7A)。我们发现在这三组中,Butyricimonas, Clostridium sensu strict 1, Ruminococcaceae UCG 009, Escherichia Shigella, Anaeroplasma的水平显著改变(图7B-F)。此外,与非POD小鼠相比,POD小鼠的Ruminiclostridium, Ruminococcaceae UCG 014, Desulfovibrio水平显著降低(图7G-I)。
 

 
 
图7 属水平肠道微生物群组成的变化。A、 属水平细菌相对丰度图(前30位)。B、 Butyricimonas(Fisher检验)。C、 Clostridium sensu strict 1(Fisher检验)。D、Ruminiclostridium(单因素方差分析)。E、 Ruminococcaceae UCG 009(Fisher精确检验)。F、Ruminococcaceae UCG 014(单因素方差分析)。G、Desulfovibrio(单因素方差分析)。H、Escherichia Shigella(Fisher试验)。I、Anaeroplasma(Fisher检验)。

种水平肠道微生物群组成的变化
    图8显示了种水平上肠道微生物群组成的相对丰度图(图8A)。与虚假手术小鼠相比,POD小鼠未培养的类杆菌水平显著降低(图8B)。此外,三组中Unidentified marine水平显著改变(图8C)。
 

 
 
图8 种水平上肠道微生物群组成的变化。A、 种水平上细菌相对丰度图。B、 未培养类杆菌水平(单因素方差分析)。C、Unidentified marine(Fisher检验)。

粪菌移植对无菌小鼠行为的影响
    抗生素治疗后14天,将非POD和POD小鼠的肠道微生物群连续14天移植到无菌小鼠体内(图9A)。第29天,四组的体重没有明显变化。移植前无菌小鼠在OFT、EPMT和BFT中表现出异常行为。有趣的是,接受非POD小鼠粪便细菌移植的无菌小鼠表现出行为改善,接受POD小鼠粪便细菌移植的无菌小鼠行为则没有改善(图9B-G)。
 

 
 
图9 从非POD和POD小鼠粪便细菌移植对无菌小鼠行为的影响。A、粪便细菌移植无菌小鼠和行为学试验计划。通过在小鼠饮用水中连续14天给予大剂量抗生素溶液治疗,建立了无菌模型。然后用来自非POD或POD小鼠的粪便细菌对小鼠进行口服治疗。行为测试在第29天进行。B、 体重(单因素方差分析)。C、 中心交叉(单向方差分析)。D、 在中心的时间(单因素方差分析)。E、 区域交叉(单因素方差分析)。F、 进入张开臂(单因素方差分析)。G、 找到食物颗粒的潜伏期(单因素方差分析)。

 



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