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miRNA在物种进化研究中的应用


    基因调控为基因功能的多样化和物种形成之间提供了一种关键的联系,但像miRNAs等许多基因调控机制是怎样在快速多样化的群体中起作用的仍不够清楚。最近在Mol. Biol. Evol.杂志上发表了一篇研究火山口湖泊中慈鲷幼鱼miRNA基因调控及其适应性的研究,揭示了物种进化的分子机制。


题目:火山口湖泊中慈鲷幼鱼miRNA基因调控及平行适应性辐射研究
发表期刊:Mol. Biol. Evol.  发表时间:2019-8-9  影响因子:14.797

    历史上,研究适应性进化分子机制的研究曾多集中在蛋白质编码序列变异上。然而,自从1969布里顿和戴维森Science文章“Gene regulation for higher cells—a theory”的发表以来,基因调控越来越被认为是物种分化的主要驱动力之一。现在,基因调控被广泛认为是适应性进化的最快和最有效的机制之一,并被认为在物种形成的初始阶段特别重要。尽管在广泛表达的蛋白质编码序列中的非同步性变化可以对表型产生主要的多效性影响,基因调控机制,如转录因子、DNA甲基化和miRNAs可以产生更精细的结果。通过对基因的调控更有利于适应和潜在生殖隔离,甚至在面对基因流时也能为遗传分化奠定基础。
 
    研究已经表明,miRNAs可以通过与mRNAs的靶向结合,通过mRNAs切割和/或翻译抑制直接下调基因表达。此外,miRNAs已被证明能调节许多参与细胞分化、细胞命运决定、增殖和组织发育等不同过程的蛋白质。作为转录后基因表达的基本调节因子,miRNAs也可以促进环境适应、表型多样化和物种形成。大多数蛋白质编码基因由miRNAs调控,miRNAs的表达通常受到严格的时空控制。此外,当存在各自的结合位点时,单个基因可以由多个miRNAs调节。在动物中,通常这些成熟的miRNAs是通过其5’端种子区与转录mRNA的3’ UTRs区域碱基互补配对的。然而,前体miRNA序列可以存在于基因组中的任何地方,这使得miRNAs在面对基因流的均质化效应时,对于适应和物种形成具有特殊的意义。
 
    本研究利用尼加拉瓜火山口湖泊中快速多样化的慈鲷鱼类 (Amphilophus spp.),研究了miRNAs在其转录后的调节作用。研究者通过对五种慈鲷鱼类物种胚胎的miRNA和mRNA测序,在mRNAs中鉴定了miRNA结合位点,并强调了在这些适应性辐射物种中存在数量惊人的新miRNA。然后,通过对表达水平的分析,研究确定了推定的表达水平呈负相关的miRNA/基因靶对,它们与miRNA在下调基因中的作用一致。此外,研究者确定的几个miRNAs/基因对显示出与海底/湖沼同域物种分化相关的表达模式,暗示这些miRNAs是同域分化潜在的分子机制。最后,由于这些候选miRNA/基因对可能在这些慈鲷鱼的表型多样化中发挥中心作用,研究者通过原位杂交来表征所选miRNA及其靶基因的表达,进一步证明miRNA调节可能在慈鲷鱼类的适应性辐射中发挥作用。这些结果表明,快速进化的miRNA调节作用即便在基因流存在的情况下也会对物种的快速进化分歧具有重要作用。
 
 
材料和方法 
    本研究使用5个鱼类物种1天龄15个样本(每个物种3个样本)及1月龄对应的12个样本。利用illumina平台进行的miRNA-Seq及mRNA-Seq检测。之后进行转录组组装、表达差异分析、序列特征分析、mRNA与miRNA结合位点分析、miRNA/基因负相关对的鉴定及免疫组化验证实验。
 
 
实验结果
    实验取样情况根据图1所示。样本经过RNA-seq和miRNA-Seq之后,使用有参和从头组装方法进行转录组分析。检测到了15,024个具有显著差异的基因,平均每个有1,502.4个,范围从188个(A. sagittae vs. A. amarillo)到3,671个差异基因(A. astorquii vs. A. amarillo)(图2a)。主成分分析表明有很强的系统遗传信号(图2b-c)。
 

图1、尼加拉瓜的湖泊和五种慈鲷鱼群体的代表性标本的照片
 
 

图2、跨物种的慈鲷样本基因表达模式。a)成对物种比较(用箭头连接)中mRNAs差异表达 (圆圈上面数字)和差异表达miRNAs(圆圈下面数字)的数量。湖间比较中差异mRNA数量最高,这反映了它们的系统发育差异。b)样本mRNA PCA散点图。c) 样本miRNA PCA散点图。

    对于每个物种,鉴定的成熟miRNAs的数量从178到289个不等,由241-369个miRNA基因编码。miRNAs和miRNA基因数量之间观察到差异的原因可以在miRNA生物发生中找到,因为相同的成熟miRNAs可以由不同的miRNA基因编码。实验发现这些慈鲷鱼类共有147个成熟miRNAs,而3-21个相同的成熟miRNAs显示出物种特异性表达(图3)。
 

图3、miRNA在一个物种中唯一表达和在五个物种中共有表达情况。五个物种的颜色代码与图2中使用的相同。点描绘了哪些物种共享miRNAs集。连接点的每一行上方的条显示了存在的miRNAs的数量。在条线图中,每个条的橙色部分表示数据集中与miRBase中已知miRNAs同源的表达miRNAs的数量。黑色代表miRBase中并不存在的miRNAs。

    通过成对的物种比较,检测到了从3对到58对强负相关的miRNA/基因,总共158对。由于在一个以上的物种对比较中检测到了其中的23个,在整个数据集上识别的唯一负相关对的绝对数量是124。这158个强负相关对涉及87个独特的基因和48个独特的miRNAs。其中,64个基因被单个miRNA靶向,而其余23个基因被多个miRNA靶向。值得注意的是,这五种miRNAs在与它们负相关的靶基因上显示了相同的假定效应信号。
 
表1、13个mRNA-miRNA强负相关对的注释。
 

    之后使用ISH验证了部分基因/miRNA强负相关对。第一个基因/miRNA强负相关对包括众所周知的miRNA let-7d(mir-69)及其预测的基因(igdcc3)。如图4所示,igdcc3的表达从孵化日降低到1日龄,而let-7d的表达在发育过程中增加,这与负调节相互作用一致。特别是在大脑的最前部,igdcc3的下调和let-7d的上调之间有明显的相关性。
 
 
图4、miRNA let-7d及其靶基因igdcc3的ISH验证。当鱼胚胎第一次孵化时,miRNA let-7d在头部和身体的整个背部区域显示低表达(a)。然而,其靶基因igdcc3表达相对较高(b)。在1 dph时,let-7d在胚胎头部的表达明显增加(c),而在同一发育阶段,其靶基因的表达减少(d)。黑色箭头表示该结构域是let-7d miRNA最显著的调节作用。

    本研究验证的第二个强负相关对为一个新的miRNA (mir-250)及其靶标(cyp3A40),其预测靶的表达在头部区域显示出弥漫的无处不在的表达模式,但是mir-250表达区域有明显的下调。因此,mir-250cyp3A40显示了负相关。
 
 
图5、miRNA mir-250及其靶基因cyp3A40的ISH。
 
 
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