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Plant Physiology:基因组复制介导的RNA N6-甲基腺苷甲基体(m6A)的进化


    2019年可谓是RNA m6A修饰研究大爆发的一年,无论是从国自然中标项目(2019国自然最全m6A RNA甲基化解析),还是文章发表情况(m6A领域热点与热点相结合)。植物研究领域更是如此,8月6日刚刚在Genome Biology上发表了《RNA methylomes reveal the m6A-mediated regulation of DNA demethylase gene SlDML2 in tomato fruit ripening》的研究论文,发现了DNA甲基化可通过调节m6A去甲基化酶基因表达的方式影响番茄果实m6A修饰,而m6A去甲基化酶反馈调节DNA甲基化,从而共同调控果实成熟。紧接着8月13日,题为《Evolution of the RNA N6-methyladenosine methylome mediated by genomic duplication》的论文又成功登上植物老牌顶级期刊Plant Physiology。今天小编就和大家一同分享下这篇文章。


 
发表期刊:Plant Physiology  发表时间:2019-8-13  影响因子:6.305

摘要一览:
    RNA N6-甲基腺苷(m6A)修饰是真核生物中最丰富的RNA表观遗传修饰形式。研究者假设m6A进化部分与复杂多倍体植物基因组中的基因组复制事件(genomic duplication events)有关。为了验证这一假设,本研究展示了玉米m6A修饰图谱,并从两个亚基因组(分别为maize1和maize2)中鉴定出与11968个m6A峰,每一个都覆盖了2200多个重复基因。在这些重复基因中,携带m6A峰值的基因在保留率上表现出显著差异。m6A的这种偏向性与多个特征序列相关,并受不对称进化速率的影响。本文还描述了m6A甲基化基因和转座因子的共同进化模式,它们可以通过全基因组复制和串联复制来介导。研究还发现了重复m6A功能因子的进化保守性和差异性,以及m6A修饰在玉米干旱胁迫响应中的潜在作用。本研究强调m6A修饰和基因复制之间复杂的相互作用,为理解基因组复制事件介导m6A进化的机制提供参考。
 
实验材料及方法
    材料取自玉米B73和Han21杂交株系,待植株生长到三片叶片完全展开时,液氮冻存叶片后提取RNA。
RNA分离和PolyA+ mRNA富集测序
    叶片RNA提取采用RNAiso Plus (Code No. 9109, TaKaRa),PolyA+ mRNA富集采用oligo (dT)25磁珠(Code No. S1419S, NEB)。
m6A-seqRNA-seq
    RNA片段化后,与anti-m6A多克隆抗体((Synaptic Systems Cat. No. 202003)在4℃孵育2小时,然后在4℃下与protein-A beads孵育2小时,之后在0.5 mg/mL N6-甲基腺苷洗脱后用乙醇沉淀RNA。文库及测序采用Illumina平台标准化方法进行,获得50 bp单端测序数据。RNA-seq为2 x 150 PE测序数据。
测序数据分析
    使用Trimmomatic v0.36工具对序列的原始读数去除衔接子序列和低质量碱基。使用FastQC检查了Trim后的RNA-seq和m6A-seq读数的质量。B73和Han21之间的SNP用GATK进行鉴定。Han21伪基因组是基于RNA-seq中鉴定的SNP构建的,参考序列为B73  (B73_RefGen_v4)。使用STAR v2.5.3a将B73和Han21 m6A-seq读序分别与玉米B73参考基因组和Han21伪基因组比对。峰值是使用“滑动窗口”方法调取的,使用R包PEA进行。为了调用m6A峰,使用25 bp滑动窗口扫描参考基因组。fisher检验用于识别富含m6A的窗口。通过使用R函数“p.adjust”,将P值矫正为错误发现率(FDR)。如果标准化读序计数的倍数变化大于2,并且FDR值小于0.05,则为显著的窗口。相邻的重要窗口合并在一起形成峰值区域。长度小于100-nt的峰从分析中排除。在三个重复中的至少两个重复中重叠的峰被合并为置信m6A峰,使用IRanges包进行。将来自四个实验处理(B73_WW、B73_DS、Han21_WW和Han21_DS)的可信m6A峰进一步合并成一组独特的m6A峰。干旱胁迫和充分灌溉条件下m6A修饰水平存在显著差异的m6A峰使用QNB软件确定,其标准为富集倍数变化≥ 2或≤ 0.5,FDR ≤ 0.05。使用topGO进行GO富集分析。
其他生信分析
    本研究m6A峰的富集基序的鉴定是使用MEME和HOMER两种软件完成的。同源基因的同义(Ks)和非同义(Ka)替换分析通过SynMap、MAFFT、KaKs_calculator等软件进行。m6A功能因子编码基因的系统发育分析与鉴定使用MEGA 7软件完成。
斑点印迹试验
    从m6A-seq数据中随机选择了两个m6A峰,分别包含UGUAU和UGUAC基序。这两个序列用作模板来合成四个RNA寡聚物。寡聚物于72℃变性3分钟。然后将样品点到Amersham Hybond-N+膜中,然后在杂交烘箱中紫外交联。交联后将膜在洗涤缓冲液中洗涤,然后在室温下用轻微摇动在封闭缓冲液中封闭。随后用anti-m6A抗体(Synaptic Systems Cat. No. 202003)过夜。将膜洗涤后用辣根过氧化物酶结合小鼠的抗兔IgG孵育。膜再次洗涤后,与ECL蛋白印迹底物在室温黑暗中孵育5分钟后显影。
m6A整体水平测定
    本研究使用EpiQuik m6A核糖核酸甲基化定量试剂盒(比色法)测定基因整体m6A水平的变化。
m6A-IP-qPCR
    使用m6A-IP-qPCR方法对特定m6A峰的m6A甲基化水平进行验证。RNA片段化后,与anti-m6A多克隆抗体(Synaptic Systems Cat. No. 202003)在4℃孵育2小时。乙醇沉淀后,对IP的RNA进行逆转录和qPCR分析。Cyclophilin (GenBank: M55021)用作对照,因为(1) Cyclophilin在m6A-seq数据中没有显示任何明显的m6A峰;(2) Cyclophilin在野生型和直链淀粉样品中的表达水平相对不变;和(3) Cyclophilin被认为是管家基因。样品进行了3个生物复制×3个技术复制。
 
实验结果
玉米转录组范围m6A图谱
    为了获得玉米转录组范围的m6A图谱,实验构建并测序了一系列m6A免疫沉淀(IP)和匹配input(对照)文库。玉米m6A峰在3’-UTR(m6A峰的74.6%)、接近终止密码子(20.8%)和编码序列(3.2%)区域富集(图1A)。终止密码子是最富集区段,其次是3’-UTR (图1B)。在对B73和Han21 m6A-seq数据的单独分析中也观察到m6A峰的类似分布模式。在基因组水平上,11219个m6A甲基化基因(即转录本携带m6A峰的基因;缩写为m6A基因)在每条染色体上分布不均(图1D)。实验观察到11968个m6A峰中有90.6%含有玉米中的典型基序RRACH(其中R代表A/G,A是m6A,而H代表A/C/U),此外还有检测到基序URUAY(其中Y代表C/U)(图1C)。斑点印迹试验,也验证m6A抗体对URUAY基序的特异性。
 

 
 
图1、玉米m6A甲基化修饰概况

m6A基因显示出与非m6A基因不同的序列特征
    为了确定可能与m6A修饰相关的序列特征, 研究者分析了m6A基因频率和不同序列特征(基因长度、外显子长度、外显子数目、GC含量、内含子长度和基因距离)之间的皮尔逊相关系数(PCC),使用10000次置换检验来评估PCC的统计显著性。结果观察到m6A基因的频率与外显子长度略有正相关,与基因长度和外显子数呈显著正相关,与GC含量和基因距离呈显著负相关 (图2A-D)。
 

 
 
图2、m6A基因与序列特征相关性分析

玉米两个亚基因组之间存在m6A基因的偏向性分离
    由于有偏向的基因分离,两个玉米亚基因组(maize1和maize2)之间重复基因的丢失是不均衡的,因此本研究探讨了m6A修饰是否也可能与重复基因保留相关的问题。结果发现maize1中的 m6A基因的单重复率显著高于maize2中的m6A基因,这与总亚基因组基因的趋势一致,另外在m6A基因与非m6A基因比例、外显子数和基因长度上也有差异(图3A),这些差异很可能是亚基因组偏向性分离的进化结果。此外还分析了玉米基因的非同义替换(Ka)/同义位点(Ks)的比率,结果显示m6A基因的的Ks值明显低于非m6A基因。这表明m6A基因进化速度更快,进化时间更短。
 

 
 
图3、玉米两个亚基因组之间m6A基因进化的影响

m6A甲基化和TEs的共同进化结果影响重复保留和表达差异
    实验还探讨了m6A修饰和玉米基因表达之间是否有关联。与m6A-seq相似,利用玉米B73和Han21幼苗的叶组织,在正常及干旱胁迫条件下进行了RNA-seq检测。结果观察到m6A基因的表达丰度明显高于非m6A基因(图4A);m6A基因的单重复率明显低于非m6A基因,反映出m6A甲基化的复制基因的总体保留率较高(图4B)。

 
 
图4、m6A修饰增强了基因稳定性及重复的保留

    在对TE相关和无关的m6A基因的和非m6A基因的距离远近等的分析表明,m6A甲基化参与了与TEs的共同进化(图5)。
 

 
图5、m6A甲基化与TEs的共同进化

m6A功能因子的进化及其对低甲基化干旱胁迫响应基因表达的影响 
    对玉米和高梁基因组分析,鉴定出多个编码m6A功能因子同源基因(图6A),对这些基因分析发现,他们具有非常类似的进化速率(图6B)。在对干旱胁迫玉米的分析后发现,在干旱胁迫敏感玉米B73品种中,ALKBH10等基因表达明显上调,同时m6A甲基化修饰水平在干旱胁迫下明显低于正常对照,表明在干旱胁迫条件下玉米的整体的m6A水平较低(图6C)。
 

 
 
图6、编码m6A功能因子基因的进化动态分析

结论与未来展望
    在这项研究中,结果强调了在植物中构建转录组范围m6A图谱的重要性,并利用玉米幼苗叶片组织中m6A-seq数据揭示了与基因组复制相关的m6A修饰的进化模式。m6A作为最丰富的内部基因修饰,在过去几年中,人们对拟南芥m6A的动态作用越来越感兴趣,这些调控机制是关键植物发育过程的基础,包括胚胎发育、茎干细胞命运、花发育和毛状体形态发生等。本文研究者预计,在未来将对来自不同胁迫环境条件下、不同作物品种、不同发育阶段和组织样本,进行转录组范围的m6A图谱检测,并通过对物种内和物种间m6A修饰的比较,进一步揭示植物转录后调控的进化模式,最终从空间、时间和环境维度来阐明不同植物物种中RNA m6A甲基化的动态变化。
 
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