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Nature Genetics:3’ UTR变短能够通过干扰ceRNA的crosstalk以反式作用方式抑制肿瘤抑癌基因
 


摘要一览
       由可变聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)引起的mRNA 3’ UTR变短(3’ US)是一种常见现象,它可以促进体内肿瘤生长。此前的假设普遍认为,这一过程通过顺式作用来逃脱由microRNA介导的对原癌基因表达抑制。本研究却发现,3’ UTR变短在被预测为肿瘤抑制基因的竞争内源性RNAs (ceRNAs)转录本中得到了惊人的富集。研究者基于3’ UTR变短(MAT3UTR)的反式效应模型分析揭示了其在改变ceRNA表达中的重要作用。MAT3UTR预测了许多3’ UTR变短的反式靶点,包括PTEN,它是一个关键肿瘤抑制基因,参与了9个3’ UTR变短基因(包括EPS15和NFIA) ceRNA 的crosstalk。对3’ UTR变短调节子基因NUDT21敲降后,以miRNA依赖的反式作用方式抑制了PHF6和LARP1抑癌基因的表达。综上所述,本研究结果表明,3’ UTR变短能够通过干扰ceRNA的crosstalk以反式作用方式,抑制肿瘤抑癌基因,而不是诱导顺式作用的原癌基因导致肿瘤发生的。

 

 
发表期刊:Nature Genetics 发表时间:2018-5-21 影响因子:27.125
 
背景介绍及研究意义
       在细胞增殖和转化过程中,普遍存在着APA引起的mRNA3’ UTR变短的发生。先前人们的假设认为,变短的3’ UTR通过逃脱miRNA介导的抑制而导致顺式中原癌基因的激活。本研究挑战了这一假设,并暗示了3’ US在肿瘤发生中的不同功能,本研究有助于深入揭示肿瘤的发生机理。
 

 
 可变聚腺苷酸化示意图
图片来源:https://en.wikipedia.org/wiki/Polyadenylation
 
 
研究方法
       RNA-Seq、miRNA-Seq及ceRNA鉴定,RIP,qRT-PCR等。
 
研究结果


 
图1、3’ US (3’ UTR shortening)基因与癌基因没有强关联。a) TCGA RNA-Seq数据显示CCND1的3’ UTR区在肿瘤(黄色)和正常样本(蓝色)之间没有明显变化。Poly(A)-seq结果观察到类似的模式。b) 358例TCGA肿瘤/正常样本中3’ US基因(红色)和所有基因(灰色)的ΔPDUI值(上图)。负ΔPDUI表示3’ US变短。下图显示了358个肿瘤/正常样本中CCND1的ΔPDUI值。可见, CCND1 3’ UTR发生显著变短的发生肿瘤的仅展非常小的部分( 358人中有8人;2.2 % )。c)前期研究鉴定的3’US基因和癌基因之间的重叠P值及比率。
 

 
图2、3’ UTR变短干扰ceRNET(ceRNA global regulatory networks)。a)乳腺肿瘤和匹配的正常组织中随机选择100000转录本对时有显著的miRNA结合位点重叠的Pearson相关系数。b)乳腺肿瘤和正常ceRNETs中ceRNA对的数量。括号中的数字为归一化的肿瘤和正常样本之间共享边数。c)EPS15 (3’ US基因)和PTEN ( ceRNA partner )在68例雌激素受体阳性乳腺肿瘤和匹配正常样本上的基因表达。水平线代表PTEN的平均表达值,在肿瘤中出现下降(FDR = 2.1×10-10 )。d)热图显示了68个ERP肿瘤/正常对(列)中按照3’ US基因的数量排序显著的APA(alternative polyadenylation)事件(行)。Venn图显示了正常和肿瘤ceRNET中ceRNA对的数量。括号中的数字为肿瘤和正常组织归一化后共享的边数。P值是根据单尾皮尔逊卡方检验计算结果。
 
 
图3、3’ UTR变短抑制TCGA乳腺癌中的肿瘤抑制基因表达。a)3’ US ceRNA hub基因(红色)、3’ US ceRNA non-hub基因(蓝色)、3’ US基因(紫色)和随机RefSeq基因(灰色)的功能富集结果。本研究随机抽样每个基因类别到相同的数量各100次;绘制了具有标准偏差的平均P值。b)3’ US ceRNAs (n = 160,左框)抑癌基因的相对表达(肿瘤/正常)低于不在ceRNET中的抑癌基因( n = 226,右框)。c)3’ US基因(左)可能通过3’UTR变短释放的miRNAs (中间)通过反式作用抑制其ceRNA伴侣PTEN表达。d)上面热图显示了9个3’ US基因(行)的APA事件。下图显示了10种肿瘤中PTEN的表达水平,其中UTR变短最多(左)或最少(右)。e)用对照(Con.)或EPS15靶向siRNAs处理的MCF细胞裂解物的Western blot分析。这幅图代表了三个独立的实验。f)为用含有PTEN 3’ UTR和EPS15靶向siRNAS的荧光素酶报告基因转染的MCF7细胞裂解物的荧光素酶活性定量结果。g)PTEN 3’ UTR荧光素酶报告基因在转染了EPS15和DICER靶向siRNAS的MCF7细胞中的活性。h)用含有载体衍生的3’ UTR (Con.)或EPS 15 3’ UTR以及GFP构建体的异源报告基因转染的MCF7细胞的间接免疫荧光。通过与Alexa Fluor - 594结合的抗PTEN抗体检测PTEN。箭头突出显示PTEN +转染的细胞。
 

 
图4、NUDT21介导的3’ UTR变短导致肿瘤抑制因子以反式作用被抑制。a) 在NUDT21敲降(KD)实验中,癌基因或抑癌基因中3’ US ceRNAs (红色)、3’ US 基因(蓝色)和RefSeq基因 (灰色)的富集情况。实验对每个基因类别随机抽取到相同的数量(n=1168) 100次,并得到标准偏差的平均P值。b)3’ US ceRNAs ( n = 57,左框)或未与3’US基因关联( n = 339,右框)的抑癌基因的表达变化。3’US ceRNA抑癌基因在NUDT21敲降样品中表达较低( P = 0.03 )。c)使用CRISPR / Cas9在HeLa细胞中敲降NUDT21的通过western blot检测。d)用AGO2抗体进行RIP实验,以正常小鼠IgG作为对照。用western blot检测RIP复合物。


 
图5、NUDT21介导的3’ UTR变短抑制肿瘤抑制基因PHF6和LARP1。a)NUDT21敲降细胞3’ US ceRNA肿瘤抑制基因(PHF6/LARP1)和3’ US基因(LAMC1/YOD1)的Western blot结果。b)在NUDT21敲降细胞和对照siRNA转染细胞中,PHF6 3’ UTR和LARP1 3’ UTR荧光素酶活性检测。c)NUDT21敲降诱导YOD1的3’ UTR变短和表达上调,使得miR-3187-3p和miR-549抑制PHF6。d),使用转染NUDT21siRNA (si-NUDT21-4)的HeLa细胞裂解物和两种阻断miR-549和miR-3187-3p的拮抗剂的western blot分析。e) PHF6 3’ UTR荧光素酶报告载体在具有siRNAs、miRNAs或拮抗剂的HeLa细胞中的活性。f)用对照siRNA或YOD1 siRNA转染的细胞裂解物的western blot分析。g)在用与f中相同的实验设计处理的细胞中PHF6 3’ UTR荧光素酶的活性。h)用siRNAs转染的细胞中PHF6荧光素酶的活性检测。
 
结论
       1、通过对TCGA数据库RNA-Seq等数据挖掘发现,3’ US基因与原癌基因不存在强关联现象。
       2、ceRNA可以通过反式作用形成调控网络(ceRNET)来控制生物活动进程。本研究通过对TCGA数据的分析发现3’ UTR变短可以干扰ceRNET。
       3、对TCGA乳腺癌数据分析及功能验证实验表明,3’ UTR变短抑制TCGA乳腺癌中的肿瘤抑制基因的表达。
       4、对3’ US关键因子NUDT21的细胞敲降实验表明,NUDT21介导了3’US ceRNA抑癌基因(如PHF6和LARP1)以反式作用被抑制。
 
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