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【昊阅读】最新文献为您比较安捷伦、罗氏、Illumima和RRBS四种甲基化测序平台
       


        在高等真核生物中,DNA甲基化是基因组表观遗传调控的基础。目前,我们已经有全基因组甲基化测序(WGBS)技术,可以覆盖基因组的所有甲基化位点,但这一技术的价格目前仍然比较昂贵,数据分析也非常的复杂。因此,对于生物学活动相关基因组高CpG区域的捕获,将能实现更高性价比的甲基化水平检测。目前,这种覆盖基因组~10%甲基化位点的“甲基化测序平台”主要包括两类,一类是基因探针杂交捕获后进行测序(简称甲基化捕获),主要包括安捷伦公司,罗氏公司,Illumina公司的甲基化捕获平台;另一种是基于Mspl酶切的RRBS(Reduced Representation Bilsulfite seuqneing,RRBS)平台,基于限制性酶的RRBS测序平台。这两类技术都可以获得达到单碱基分辨率的甲基化水平检测结果,因此结果都比较准确,有利于后期的验证阶段工作。在甲基化标志物筛选研究中,都是非常关键的技术。
 
        今天,小编和大家一起阅读一篇技术平台比对最新文章,看看现今的4种甲基化测序平台,各有什么样的优劣势。
文章题目:“Same difference”: comprehensive evaluation of four DNA methylation measurement platforms
杂志:Epigenetics Chromatin
影响因子:5.351
发表时间:2018-05

本文对比的四种甲基化测序平台 (4个平台均覆盖人类基因组甲基化谱的10-13%
       (1) 基于酶切的简化基因组测序-RRBS平台
       (2) 基于捕获的Agilent SureSelect Methyl-Seq ---安捷伦SSMethylSeq平台
       (3) 基于捕获的Roche NimbleGen SeqCap Epi CpGiant---罗氏CpGiant平台
      (4)基于捕获的 Illumina TruSeq-Methyl capture EPIC--- Illumina TruSeqEpic平台
 
四种甲基化测序平台覆盖度比较
        安捷伦SSMethylSeq 和 Illumina TruSeqEpic 主要是针对一条DNA链进行捕获;但是某些含有SNP的DNA区域,Illumina TruSeqEpic 技术平台也会针对2条DNA链都进行捕获;RRBS,罗氏CpGiant可以从2条DNA链都进行片段捕获。依据下图(左),RRBS 的片段获取长度约为84-334bp(文库制备胶回收步骤的人为选择),这一长度范围和安捷伦SSMethylSeq 技术平台较为接近。而罗氏CpGiant捕获区域通常更长,并且罗氏CpGiant和Illumina TruSeqEpic的长度分布比较广。基于捕获区域的重叠性分析(下图右),3个捕获平台之间的捕获区域重叠性较高。但可以观察到,4个平台的靶向区域还是有一定差别的。


 
实验操作参数比较


 
        依据上表的参数对比,RRBS需要的DNA用量最低,而安捷伦SSMethylSeq需要至少1μgDNA。价格上,4种平台的价格都很低廉,仅占WGBS(全基因组甲基化测序)的3.3~15.5%。
 
序列比对情况和正负链平等性情况比较
       依据下图(左),四个平台的唯一比对序列占比平均能达到72.8%(SD=7.5%)。相比较而言,RRBS的未匹配序列或者模糊匹配序列占比较高(粉色和灰色区域)。下图(右)再一次强调了,安捷伦SSMethylSeq 和 Illumina TruSeqEpic 主要是针对一条DNA链进行捕获;而RRBS,罗氏CpGiant,WGBS可以从2条DNA链都进行片段捕获。这一点对于关注链特异性甲基化水平的研究者比较关键。


 
CpG理论靶向区域的覆盖率情况
        对于CpG位点测序read≥10的位点,我们定义为CpG单元。下图(左)统计了不同技术平台对于不同类型CpG单元的统计值。ERRBS, SSMethylSeq, CpGiant  (平均都能获得121M的双端测序read), TruSeqEpic 约获得54M的双端测序read) 三个平台获得的CpG单元数量约为3.84M;而WGBS获得的测序量约为300M的read,覆盖的CpG单元约为14.4M。对比各个技术平台,ERRBS平均覆盖了其理论靶的CpG单位区域的67.9%。 罗氏CpGiant则平均覆盖了其预期CpG单位区域的98.3%(下图右)。


 
CpG重叠单页的甲基化水平检测一致性(下图左侧MA图)
        对于重叠检测到的CpG位点,4种平台的甲基化水平一致性很高,说明甲基化水平检测在不同平台之间主要是检测区域的差别,而检测出的甲基化水平是高度一致的。


 
基因功能区域的覆盖情况对比
       甲基化捕获平台为预先设计探针,重点捕获已知在表观调控中扮演重要作用的基因组功能区域,例如CpG岛、CpG shore,启动子区,部分内含子和外显子区,因此三个捕获平台对基因功能区的覆盖情况差别不大。RRBS也能覆盖相同的区域,但覆盖度偏低一些(下图 a)。对于在未注释基因区域,RRBS 技术平台覆盖度最高(下图c)。
 

 
总结
        总的来说,对于其目标检测区域,每个平台都有很高的捕获效率,但是不同平台的捕获区域还是有一定差别的。SSMethylSeq和CpGiant覆盖大约70%的相同CpG,TruSeqEpic和其它捕获方法捕获的共同CpG约为40-50%,而RRBS只有~30%的捕获区域与其他捕获方法重叠SSMethylSeq,CpGiant和TruSeqEpic在他们设计的捕获区域中覆盖率超过90%,而RRBS对其预期靶向区域的覆盖率约为70%。因此,基于捕获的甲基化测序平台比RRBS更精确地覆盖了它们的预期靶向区域。
        RRBS可提供与捕获平台相当的CpG数据,但在CpGs谱中提供更多的可变性(即未知区域的数据)。
        甲基化水平检测在不同平台之间主要是检测区域的差别,而检测出的甲基化水平是高度一致的。
        安捷伦和罗氏还为甲基化的测量设计个性化定制捕获。
        安捷伦SS Methyl Seq捕获平台可用于低质量DNA(降解)的甲基化水平检测,是FFPE组织的一个理想甲基化检测平台。

 
 
 




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