咨询热线:400-065-6886   天昊基因

中文 / English

主页 > 技术服务 > mRNA甲基化(m6A)测序

mRNA甲基化(m6A)测序

mRNA甲基化(m6A)测序

服务介绍:

    N6-甲基腺嘌呤(m6A)修饰是真核生物mRNA中最普遍的内部修饰,通常m6A修饰嵌入在5’-DRACH-3’ (D=G/A/U, R=G/A, H=A/U/C))保守的共有序列中,而且主要富集在终止密码子区域,表明m6A修饰的分布特征可能具有重要的生物学功能。m6A RNA甲基化测序(MeRIP-seq或m6A-seq)是以RNA免疫共沉淀 RIP为基础,采用特异抗体对发生m6A甲基化修饰的RNA片段进行富集后测序的技术手段,能够准确识别~100个核苷酸区域的m6A修饰,在RNA表观遗传学领域被广泛采用。

技术参数及分析内容


技术优势


   • 开放的全转录组分析:无需预先设计探针,无需预知mRNA甲基化位点信息
   • 信息量大:在全转录组水平上获得mRNA和poly(A)+长非编码RNA的甲基化修饰区域信息
   • 准确性高:以未经抗体富集的mRNA文库作为input对照,校正mRNA表达量的影响,获得准确可靠的甲基化区域信息。

技术路线


经典案例解读

文章标题:METTL3 facilitates tumor progression via an m6A-IGF2BP2-dependent mechanism in colorectal carcinoma

发表杂志:Molecular Cancer

影响因子:10.679

发表时间:2019年6月

    中山大学肿瘤防治中心徐瑞华教授和鞠怀强教授团队在结直肠癌(CRC)中发现METTL3能够基于m6A-IGF2BP2的机制促进肿瘤进展。鉴于结直肠癌中并未有太多关于m6A RNA甲基化修饰的报道,本研究首次在结直肠中证实了METTL3促癌的功能。

主要研究结果:

1. METTL3在转移性CRC中高表达且与不良预后相关

    首先在TCGA数据库中发现多个m6A相关‘写蛋白/擦除蛋白/读蛋白’的表达水平在结肠癌中异常表达(Fig.1a),qPCR验证了其表达水平(Fig.1b)。由于METTL3在多个癌种中被证实高表达,进一步验证发现METTL3在复发性CRC组织和转移性肝组织也呈现表达上调(Fig.1c),而且mRNA和蛋白水平在CRC细胞系也显示上调(Fig.1d-e)。
    METTL3蛋白水平在CRC患者中表达上调(Fig.1f),免疫组化结果验证了METTL3在CRC组织、淋巴结和肝转移组织中都显示出高表达(Fig.1g-h)。更重要的是,METTL3高表达的患者化疗效果更差(Fig.1i),整体生存率和无病生存率更低(Fig.1j)。

2. SOX2受METTL3介导的m6A修饰调控

    METTL3在SW620细胞中显示比SW480中具有更高的表达(两种细胞系具有不同的转移潜能,Fig.2a),然后利用MeRIP-seq和RNA-seq在SW480、SW620和METTL3敲降的SW620细胞中寻找潜在的靶点。综合分析差异的甲基化peak和表达水平,发现与SW480细胞相比,SW620细胞中733个高甲基化peak同时具有更高的表达水平;在敲降的细胞中3393个低甲基化peak具有更低的表达水平(Fig.2b)。从这两组结果中发现192个特异性的peak被共享(Fig.2c),与158个基因相关,通路富集发现这些可能参与干细胞分化的通路中(Fig.2d)。
    进一步对候选的基因分析发现四个基因SEMA3A、BCHE、ZFP36L2和SOX2在SW620细胞中显示出m6A修饰的大幅增加,而在敲降细胞中显示一致的减少(Fig.2e)。然而m6A-qPCR实验证实SOX2的m6A水平在敲降细胞中下降得最显著,因此SOX2可能作为METTL3的潜在靶点参与到促进CRC干性和转移过程中(Fig.2f-h)。

3. 体外实验证实METTL3促进CRC细胞干性

    在METTL3敲降的SW620细胞中球体数目(Fig.3a-b)、菌落形成、侵袭能力均受影响(Fig.3c),而对奥沙利铂的化疗敏感性增加(Fig.3d),癌症干细胞表面抗原CD133、CD44和EpCAM在METTL3被抑制后显著下降(Fig.3e),同时METTL3下游基因也被显著抑制(Fig.3f),另外SOX2过表达能够rescue干性下降的表型(Fig.3g-i)。这些结果表明METTL3在CRC细胞中的致癌的角色,主要通过维持SOX2的表达实现促进肿瘤的自我更新、细胞侵入和化疗抗性。

4. 体内实验证实METTL3驱动CRC肿瘤发生和转移

    通过异种移植实验发现METTL3敲降的细胞移植后肿瘤生长速率下降、肿瘤体积减小(Fig.4a-b);免疫组化发现尾静脉注射对照组SW620细胞的小鼠会出现更多的肺转移结节(Fig.4c)。同样地,SOX2过表达能够rescue肿瘤形成的功能(Fig.4d)。利用PDX模型瘤内注射siRNA评价METTL3的治疗作用,主要结果也与上述一致(Fig.4e-h)。因此,体内实验确实证实了METTL3在CRC中的成瘤和转移作用。

5. IGF2BP2基于m6A修饰的方式增加SOX2 mRNA稳定性

    先前有研究发现两类m6A读蛋白(readers)家族可能控制着甲基化修饰的mRNA的命运,如YTH家族和IGF2BP家族。为了揭示SOX2特定的m6A readers,利用链霉亲和素RNA pull down实验检测相关的readers,发现IGF2BP2特异性地结合在SOX2全长转录本上,而非IGF2BP家族其它成员或YTH家族(Fig.5a)。而且pull down实验也证实了IGF2BP2主要结合在CDS区,在motif缺失后特定的结合也会受到影响(Fig.5b)。RIP实验同样地证实了IGF2BP2和SOX2 mRNA之间直接的影响(Fig.5c)。
    在抑制IGF2BP2后SOX2蛋白和mRNA水平、SOX2下游基因表达水平均受到显著抑制,IGF2BP2和SOX2转录本之间的作用也会受到METTL3的影响(Fig.5d-h)。在抑制METTL3或IGF2BP2后,SOX2 mRNA表达水平开始下降,而且其半衰期显著变短(Fig.5i-j)。这些结果都能说明IGF2BP2确实充当reader的角色,维持SOX2转录本的稳定性。

6. METTL3/SOX2/ IGF2BP2在CRC中的临床相关性

    基于以上机制的发现,利用临床样本分析METTL3/SOX2/IGF2BP2之间的相关性,包括免疫组化实验、表达相关性,利用三个marker的IHC数据对CRC患者进行预后的预测,三者的高表达显示了最差的预后,因此可以建立一个很好的预测模型(Fig.6)。

总结讨论

    本研究发现了METTL3对于CRC进展的关键作用及可能基于m6A的机制,METTL3-IGF2BP2-SOX2之间的调控作用是基于m6A这一表观调控机制来实现的,另外PDX模型显示METTL3作为潜在靶点可能具有一定的治疗作用。

m6A peak在基因组各区域内的分布

Peak calling结果

Motif分析结果展示

Peak相关基因GO富集条形图

KEGG富集分析散点图

上海天昊生物科技有限公司 版权所有 沪ICP备17008908号
地址:上海市浦东新区康桥路787号9号楼 邮箱:techsupport@geneskies.com 电话:400-065-6886