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动植物线粒体/叶绿体测序

动植物线粒体/叶绿体测序

技术简介:

       线粒体是细胞中制造能量的细胞器,叶绿体是绿色植物进行光合作用的细胞器,因此线粒体与叶绿体都是细胞内进行能量转换的场所,两者均为半自主性细胞器,均具有自身的遗传物质和遗传体系。线粒体DNA(mtDNA)因独有的母系遗传模式和较高的突变频率, 已被广泛用于生物进化,群体结构,疾病诊断,法医等方面的研究。而叶绿体DNA(cpDNA)在揭示物种起源、生物进化及不同物种之间的亲缘关系等方面也具有很重要的作用。二代测序可以简便快速、高通量获得线粒体/叶绿体DNA 序列信息,因此动植物线粒体/叶绿体测序在进化生物学研究,疾病诊断和法医学领域都具有十分重要的应用价值。

技术优势:

      实验方案灵活:客户根据不同需求,采取合适的测序方案实验体系严格:从DNA抽提和质检,到文库构建和上机测序有严格的实验流程,从而保证了数据的高精准度分析团队强大:拥有强大的生物信息团队,除提供标准生物信息服务外,还提供个性化的生物信息服务
      团队经验丰富:已经完成多种物种的线粒体/叶绿体随即测序,天昊客户1种SCI期刊+1年半时间+7篇文章。

技术策略及适用范围:



• 一代Sanger测序

通常针对叶绿体和线粒体特征基因扩增后的产物进行测序,以及对二代随机测序中存在的较小片段Gap进行补测成环。

• 二代Illumina随机测序

通常为绝多数动物类线粒体,和相对较小的叶绿体、线粒体基因组。

• 三代PacBio长片段测序

a) 主要针对拥有较大线粒体、叶绿体基因组情况,并且重复区域等较多,结构复杂,导致测序覆盖度差,只用二代随机测序无法成环且无法用一代测序补Gap的情况。

b) 无高质量叶绿体、线粒体参考基因组,适用近缘物种参考基因组无法成环情况。

技术参数


技术参数


测序方案 样本要求 方式 数据要求 优势 劣势 特点
对Total DNA样品进行测序
 
  • 类型:无降解,无污染的DNA
  • 总量:>1μg
  • 浓度:>20ng/μL;
  • 纯度:OD260/280=1.7-2.0
  • Hiseq 2×150
  • Q30>80%
  • Raw data:Illumina随机测序数据量:2 G/样 PacBio SMRT测序:>100X
  • Hiseq 2×150
  • 样本要求低实验流程简单实验周期短
  • 有效率受样本基因组大小和细胞器拷贝数影响较大,随机性较高
  • 适用于有近缘物种线粒体或者叶绿体的参考序列

技术路线及分析内容

二代随机测序技术路线



三代PacBio测序技术路线


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经典文章解读

Characterization of the complete chloroplast genome of Cephalotaxus sinensis (Cupressales: Taxaceae), an endangered Tertiary relict tree endemic to China

题目:中国第三纪特有孑遗种粗榧完整叶绿体基因组特性研究

发表杂志:Conservation Genetics Resources

发表时间:2018-3

研究背景:

      粗榧是第三纪濒危地方性残留树种, 具有较高的药用价值。为了促进其保护遗传学研究, 本文利用 Illumina 高通量测序技术,对其完整叶绿体基因组进行了组装。

研究方法:

      用DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN,German) 从将粗榧鲜嫩叶片中提取基因组DNA,质检初步合格后,送上海天昊生物有限公司进行高通量DNA测序。利用Illumina HiSeq 2500测序系统共产生了15.4 M 150-bp的raw reads,平均测序深度达到叶绿体基因组的214X,用CLC Genomics Workbench v9 (CLC Bio, Aarhus, Denmark)对数据进行质控,并MITObim v1.9软件(https://github.com/chrishah/MITObim)对叶绿体基因组进行组装,以Cephalotaxus oliveri (KC136217)的叶绿体基因组为参考基因组。利用Geneious R10软件 (Biomatters Ltd., Auckland, New Zealand)对叶绿体基因组进行注释,并利用OGDRAW软件(http://ogdraw.mpimp-golm.mpg.de)绘制物理图谱。系统进化树利用MEGA6软件(http://megasoftware.net)进行。

研究结果:

      叶绿体基因组全长为135646 bp,具有不对称的碱基组成 (32.5% A、17.6% C、17.5% G和 32.4% T),共编码了113个unique基因 (包括82蛋白质编码基因、27个tRNA基因和4个rRNA基因),其中trnQ-UUG具有基因组复制现象。此外,14个基因 (atpF、ndhA、ndhB、petB、petD、rpl2、rpl16、rpoC1、rps12、rps16、trnA-UGC、trnG-UCC、trnI-GAU和trnK-UUU) 具有一个内含子, 另一个基因 (ycf3) 有一对内含子。系统进化分析基本上支持了目前柏目(Cupressales)层次分类的顺序, 揭示了粗榧与同源物种蓖子三尖杉的密切关系。

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图1、粗榧叶绿体基因组的物理图谱。外圆外侧显示基因按照顺时针方向转录,而外圆内侧

      显示基因按照逆时针方向转录。内圆中的浅虚线区域和深灰色区域分别表示基因组的A+T和G+C含量。

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图2、基于叶绿体蛋白质编码基因(protein-coding genes,PCGs)对Cupressales 38种植物的系统发育关系的NJ分析,分类单元为属级水平

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